Трансген это: Трансген | это… Что такое Трансген?
Трансгенное поле битвы / Наука / Независимая газета
Европейцы, протестующие против продвижения США на рынки Старого Света генетически модифицированных продуктов, загримированы под президента США Джорджа Буша.
Фото Reuters
В XVIII веке стало ясно, что прививка коровьей оспы (вакцинация) защищает человека от заболевания «черной» оспой, и люди перестали чувствовать себя беззащитными перед этим страшным злом. В России для преодоления страха населения перед вакцинацией императрица Екатерина II вынуждена была первой подвергнуть себя этой процедуре и выжила вопреки ожиданиям своих подданных.
Все новое, в том числе и хорошее новое, страшит. Особенно «пуглива» наименее образованная и поэтому агрессивная часть населения. Очень характерен в этом отношении пример с историей попыток внедрения в России технологии создания и культивирования трансгенных растений, в частности – картофеля.
Живые генетические фабрики
═
Площадь под трансгенными культурами возросла за последние 9 лет в 40 раз и составила в 2003 г. около 68 млн. гектаров. В производство генетически модифицированных растений (ГМР) разных видов вовлечены 7 млн. фермеров в США, Канаде, Румынии, Болгарии, Испании, Аргентине, Бразилии, Уругвае, Индии, Австралии, Филиппинах, Южной Африке, Японии. ГМР используются в качестве пищи человека или кормов для животных в странах обоих полушарий. В Китае создание и культивирование трансгенных растений – приоритетное направление обеспечения национальной безопасности.
Я напомню: создание технологий конструирования трансгенных растений – революция в области селекции и растениеводства. Эта технология позволяет, например, получить растения, устойчивые к ряду высоко патогенных вирусов, вироидам, грибковым и бактериальным инфекциям, насекомым-вредителям, растения с высоким содержанием витамина А, устойчивые к холоду, засоленности почв, засухе, растения с улучшенным содержанием и составом белков и т.
При создании ГМР применяются разнообразные стратегии, которые на первый взгляд могут показаться противоречивыми. С одной стороны, создаются растения, устойчивые к насекомым, т.е. не требующие применения ядовитых инсектицидов (картофель, кукуруза, хлопчатник), а с другой – растения, устойчивые к определенному гербициду (соя, рапс, свекла). Но на самом деле в этом нет никакого противоречия. К примеру, устойчивость генетически модифицированной свеклы к высоко эффективному гербициду широкого спектра действия позволяет практически полностью уничтожить сорняки, не влияя на сами растения свеклы. С точки зрения объективного и психически уравновешенного человека, в этих результатах, как говорится, «нет ничего плохого, кроме хорошего».
В этой связи, история создания генетически модифицированного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, увлекательна и поучительна.
═
Защита «полосатых» насекомых
═
Известно, что среди почвенных микроорганизмов встречаются продуценты очень полезных для человека веществ, например, антибиотиков. В частности, оказалось, что некоторые почвенные бактерии продуцируют белок, который токсичен для колорадского жука, но абсолютно безвреден для человека. Поэтому ген, кодирующий синтез этого белка, был выделен из бактерий и встроен в геном картофеля. В результате попытки прожорливых полосатых жуков пополнить свой пищевой рацион за счет трансгенного растения, обернулись для них глубоким разочарованием и гибелью.
К сожалению, появление трансгенных сортов вызвало разочарование не только у жуков.
Трансгенный картофель или кукуруза сами защищают себя от насекомых-вредителей, не требуя применения пестицидов! Какое впечатление такая новость могла произвести на руководителей химической промышленности, производящей миллионами тонн пестициды для защиты растений от насекомых? Реакцией на появление такого «хорошего нового» стала организация кампании дискредитации трансгенных растений.
Пожалуй, самый глупый и поэтому популярный аргумент, применяемый противниками трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, состоит в том, что «генетически измененную картошку отказываются жрать даже колорадские жуки, которые спокойно переносят самые ядовитые опрыскивания» (В.Степанов, «Парламентская газета», 15.07.03).
═
Трансгены и онкогены
═
Тщательный анализ показал, что в научной литературе отсутствуют достоверные сведения о какой-либо опасности «трансгенной» пищи для млекопитающих. Тем не менее один из противников такой пищи, В.В. Кузнецов (кстати, директор Института физиологии растений РАН) думает иначе. «Есть шанс, что трансгены окажутся опасными для здоровья человека», – сообщает директор, не отдавая себе отчета в том, что, для того чтобы этот «шанс» сделать реальным, следует использовать в качестве трансгена что-нибудь вроде гена змеиного яда.
Обычно при обсуждении «опасностей», связанных с ГМ-пищей, выдвигается идея о тяжелых последствиях ее потребления не только для нас, но и для наших детей, внуков и в особенности – отдаленных поколений, судьбу которых по понятным причинам прояснить не представляется возможным и которые не смогут возразить, даже если будут питаться только «трансгенной» пищей.
Дело в том, что новые свойства трансгенного растения зависят от белка – продукта нового гена (трансгена), а главное условие при конструировании трансгенных растений – присутствие этого белка не должно отрицательно влиять на окружающую среду и людей, потребляющих продукты ГМ-растений.
В случае устойчивого к колорадскому жуку картофеля оба эти требования выполнены. Это доказано в специальных опытах при испытаниях на биологическую безопасность, проводившихся в ряде стран, включая Россию.
Сигналов об онкогенном влиянии устойчивого к жуку картофеля не поступало ни из одной из стран его выращивания, включая США, где трансгенная пища потребляется в течение минимум десяти последних лет. Кто-кто, а граждане США не преминули бы затаскать по судам фирму, производящую ГМ-картофель, при наличии минимальных подозрений на связь трансгенного картофеля с любыми заболеваниями.
В течение тысячелетий меню жителей разных стран включает мясо млекопитающих (коровы, свиньи, бараны и др.
Известно, что все онкогены (т.е. гены, ответственные за превращение нормальной клетки в раковую) имеют свои аналоги (протоонкогены) в геноме нормальных клеток животных. Все вирусные онкогены имеют клеточное происхождение, и известны механизмы превращения протоонкогенов в онкогены. Таким образом, беспечно поедая животных, – включая сюда змей и прочих перечисленных выше гадов! – человек вводит в свой пищеварительный тракт ДНК тысяч генов, включая протоонкогены. При потреблении сырого мяса эта ДНК даже не подвергается тепловой обработке.
Нередко противники ГМ-культур ссылаются на результаты работы (PNAS USA, 94, 961), в которой мышам через рот вводили очищенные препараты высокомолекулярной ДНК бактериофага М13. В этой работе сообщалось о возможности проникновения фрагментов ДНК из пищеварительного тракта в кровь, лейкоциты и лимфоциты животных, а также о вероятности встраивания фрагментов ДНК в геном клетки.
Однако весьма очевидно, что условия такого эксперимента не соответствуют нормальным условиям потребления ДНК в составе растительной пищи, где она существует не в «очищенной» форме, а в виде сложных комплексов с клеточными белками. Кроме того, в случае картофеля ДНК потребляется после жестких тепловых обработок.
Правда, авторы упомянутой работы и не ставили целью проверку судьбы ДНК трансгенов в организме животных.
Полагаю, что противники ГМ-пищи были несколько разочарованы результатами недавних опытов (J. Animal Science, 2003, 81, 2546) по кормлению свиней трансгенной и обычной (в контроле) кукурузой. В пищеварительном тракте обеих групп животных были обнаружены фрагменты ДНК ряда генов нормальной (нетрансгенной) кукурузы, что не является неожиданностью. В дополнение к этим «нормальным» ДНК в пищеварительный тракт свиней, кормившихся трансгенной кукурузой, поступили фрагменты ДНК трансгена. Это тоже понятно и естественно. Важный вывод авторов состоял в том, что ни фрагменты ДНК нормальных клеточных генов, ни ДНК трансгена не были обнаружены в крови подопытных животных.
Эти результаты позволяют заключить, что в природных условиях питания из организма с одинаковой эффективностью выводится любая ДНК, поступающая с пищей, включая как ДНК трансгена, так и обычных клеточных генов.
═
«Страшилки» про крыс
═
Несколько лет назад противников трансгенных культур возбудило сообщение А. Рusztai о том, что трансгенный картофель, содержащий трансген лектина, снижает иммунный ответ у подопытных крыс.
Последующая работа специальной комиссии ученых дезавуировала эти результаты. Выводы комиссии были однозначны: потребление трансгенного картофеля крысами «не повлияло на их рост, развитие органов или иммунные функции». Недомогание части крыс в опыте Рusztai объяснялось накоплением природных токсинов нормального картофеля в условиях культуры ткани. Кроме того, крысы (в отличие от мышей) вообще плохо усваивают картофельный крахмал и, вероятно, поедали его с отвращением.
Тем не менее в СМИ стали регулярно появляться сообщения под паническими названиями.
Первоначально это выражалось в форме сочувствия подопытным крысам. «Измененный с помощью генной инженерии картофель нанес ущерб иммунной системе подопытных крыс», – с грустью сообщило агентство ИТАР-ТАСС (10.08.98). Далее события приняли более драматический характер.
«Крысы от трансгенной картошки чахнут», – сообщает ИНО (13.08.98). «Крысы отравились трансгенной картошкой» («Общая газета», 02.09.98). Ситуация стала напоминать публикацию медицинских бюллетеней о состоянии угасающего здоровья, в данном случае – крыс. Состояние крыс, потребляющих трансгенный картофель, озаботило даже солидные «Известия» (15.08.98). «Крысы от трансгенной картошки дохнут», – сообщил В.Скосырев.
Широкую публику легко убедить, что трансгенные растения – это опасные «мутанты» (хотя они мутанты не в большей степени, чем обычные растения), поскольку понятие о мутантах обыватель связывает с жуткими монстрами из кинофильмов Стивена Кинга. Такая оценка трансгенных растений вполне совпадала с позицией ряда СМИ.
«Ужас, что едим», – восклицал журнал «Эхо планеты» (07.02.99). «Ирландцы – против еды Франкенштейна», – сообщает ИТАР-ТАСС (08.03.99), имея в виду ГМ-пищу.
Тихий обыватель, вряд ли отличающий Франкенштейна от франкмасонов, сразу усваивает, что «трансгенная» еда – это плохо, а дурацкий термин «еда Франкенштейна» становится популярен. «Народы мира против еды Франкенштейна», – заявляет Н.Саввина в «Коммерсанте» (13.03.99), по-видимому, имея в виду, что в своем отношении к Франкенштейну за истекшие пять дней после публикации ИТАР-ТАСС, к ирландцам присоединились остальные народы.
Кампания против трансгенных растений наращивает обороты. Создается впечатление, что некоторые СМИ внезапно прониклись ужасом от перспективы разделить судьбу упомянутых выше крыс.
Следует заметить, что опыты с трансгенным питанием обычно проводятся на мышах, которые являются признанной в науке «моделью» по отношению к человеку. Твердо установлено, что потребление трансгенного картофеля не оказало на мышей отрицательного воздействия.
Если бы мыши, питавшиеся устойчивым к жуку картофелем, умели читать, они бы обхохотались, ознакомившись с публикациями этой серии, так как чувствовали себя вполне комфортно, хотя вынуждены были есть картофель в сыром виде. Безвредность такого питания для мышей доказана опытами в шести странах мира, включая Россию.
Опыты российского Института питания, проводившиеся не только на мышах, но и с привлечением добровольцев, продемонстрировали безопасность потребления такого картофеля. Естественно, что, делая такой вывод, ученые не дают гарантий бессмертия даже контрольной группе потребителей обычной пищи. Ни один корректный ученый не может дать прогнозов безопасности на будущие десятилетия. Главная аргументация противников трансгенных растений основана именно на этом.
═
«Гнусная раса суперсорняков»
═
В среде журналистов, противников трансгенных растений, почему-то принято писать статьи в разнузданно вульгарном стиле.
Типичным примером служит статья Е.Пичугиной «России грозит еда», опубликованная в газете «Московский комсомолец» (04.10.03). Автор обличает в ряде грехов «лоббистов модифицированной еды», которые «уже придумали, как нас облапошить» и «втюхать мутанты…», которым запрет на выращивание «трансгенных овощей… будет по барабану», а все будет тип-топ». Почему-то Пичугина вдруг высказала неуверенность в канцерогенности трансгенной пищи. «Возможно, употребление в пищу генно-модифицированной (ГМ) еды и не приводит к раку – это еще неизвестно», – пишет автор. Как это, неизвестно? Вначале напугали население страны опасностью онкологических заболеваний при потреблении ГМ-пищи, а теперь выясняется, что это «еще неизвестно»?
Однако надо отдать должное Пичугиной: она немедленно указала на новые недостатки ГМ-пищи. «В конце 1990-х годов американцы помешались на одной трансгенной добавке, – пишет Пичугина. – Люди стали заболевать и даже умирать от мучительной боли в мышцах и от удушья». Автор не упоминает о природе добавки, на которой «помешались американцы», а главное – об известном факте отсутствия какой-либо связи между загадочной «одной трансгенной добавкой» и причинами, вызвавшими столь грустные последствия.
Между тем в кратком изложении история такова.
Более 20 лет назад в Японии были созданы бактерии-продуценты аминокислоты триптофана. Триптофан потребляется человеком в значительном количестве (до 1 г в день), а при недостатке его в организме возникают некоторые заболевания. Применение «генно-инженерного» триптофана абсолютно безвредно. Однако в рассматриваемом случае технология выделения этого препарата из клеток бактерий не обеспечила достаточно высокого уровня его очистки. Этот факт был установлен в США в судебном порядке.
Таким образом, эта история не имеет никакого отношения к генной инженерии и «трансгенным» добавкам (The Australian, 19.02.02), так как независимо от происхождения триптофан остается триптофаном, однако он должен быть хорошо очищен в случае применения в качестве лекарства или пищевой добавки.
Одно из возражений, высказываемых по поводу выращивания трансгенных растений, – опасение возможного возникновения «гнусной расы суперсорняков» в результате перекрестного опыления и передачи трансгена нормальным растениям, в том числе растениям дикой флоры.
Но такая возможность контролируется в специальных опытах по проверке ГМ-растений на биобезопасность. Здесь важно лишь отметить, что картофель оказался неспособен к перекрестному опылению с родственными растениями дикой флоры.
В качестве одного из аргументов противники трансгенных растений нередко отмечают, что вставка трансгена в геном растения носит не направленный, а случайный характер, а это может привести к нарушению регуляции генов и образованию аномальных форм. Это верно, однако следует заметить, что задача последующей селекции при создании сорта – именно удаление всех форм, отклоняющихся от нормы.
Заметим также, что все эти опасности существуют и при получении новых сортов традиционными методами, в частности методом отдаленной гибридизации с последующим отбором. Но никто не высказывает беспокойства по поводу перестройки генома растений при отдаленной гибридизации и опасений по поводу непредсказуемости результатов для потомства и для окружающей среды, хотя в процесс гибридизации может быть вовлечен не один, а множество генов.
Точно так же не существует запретов на получение сортов методом радиационного мутагенеза, хотя эта процедура основана на непредсказуемых и неконтролируемых мутационных изменениях генома растений.
Между тем при появлении трансгенного растения, содержащего всего один новый ген, «антитрансгенное» лобби открывает огонь из всех орудий с целью дискредитации этих результатов в глазах общества. О причинах столь избирательного отношения нетрудно догадаться. Существуют силы, интересы которых нарушаются слишком быстрым развитием этой области биотехнологии.
Обычно представители антитрансгенного лобби ссылаются на отрицательную позицию Евросоюза в отношении культивирования трансгенных растений. Однако сегодня это оружие несколько устарело. В Европе реализуется так называемая «концепция сосуществования», обеспечивающая фермерам возможность выращивать генно-модифицированные и обычные культуры. Противодействие в отношении ГМР, существующее в ряде стран ЕС, несомненно, носит в большей степени политический и конъюнктурный, чем научный характер.
К сожалению, в России усилия противников генетически модифицированных растений достигли желаемого результата. Сегодня большинство наших граждан пришло к заключению, что трансгенный картофель несъедобен, хотя с успехом может использоваться как средство для уничтожения крыс. Это неудивительно, так как поток «страшилок» смог бы отбить аппетит даже у привыкшего ко всему населения.
Я верю, что даже с помощью недобросовестных ухищрений развитие биотехнологии нельзя задержать надолго. Пройдет не так много лет, и недорогие, продуктивные трансгенные культуры найдут широкое применение в России. А о лицах, столь агрессивно препятствовавших распространению ГМ-растений, будут вспоминать, как сегодня мы вспоминаем об успехах лысенковцев в августе 1948 года.
Трансгенные животные | Наука и жизнь
Успехи генетики, молекулярной биологии и других биологических наук дали ученым возможность работать с изолированными генами высших организмов. Можно выделять гены, выяснять некоторые механизмы их работы и конструировать новые, гибридные гены, не существующие в природе.
Такие гены можно вводить в клетки бактерий и высших организмов, и они способны встраиваться в наследственный аппарат клеток. А дальше можно получить животных, содержащих в каждой клетке чужеродные гены. В конце 70-х и начале 80-х годов в некоторых лабораториях мира и Советского Союза были начаты работы по введению чужеродных генов в оплодотворенные яйцеклетки мыши как наиболее доступного и генетически изученного объекта. Животные, содержащие чужеродные гены, получили название трансгенных. В настоящее время уже имеются некоторые успехи в получении трансгенных мышей и их использовании для решения тех или иных биологических задач. Об этих работах рассказывают научные сотрудники Л. С. Попов (Институт молекулярной генетики АН СССР) и Л. Г Эшкинд (ВНИИбиотехнологии), ведущие исследования в этой области.
Нормальная и карликовая мыши.
Нормальная мышь рядом с трансгенной мышью, в геном которой ввели гормон роста.
Схема получения трансгенных мышей. В изолированную хирургическим путем уже оплодотворенную яйцеклетку вводятся гены.
Эту клетку подсаживают ложнобеременной, то есть предварительно спаренной со стерильным самцом, самке. Она становится приемной матерью. Из выведенных искусственно яйцеклеток рождается потомство. Поскольку не все мышата получают чужеродный ген, необходим молекулярный анализ их генома для подлинного выявления трансгенности.
Действие трансгена. Возможные сочетания половых клеток (яйцеклеток и сперматозоидов) при оплодотворении приводят к образованию четырех типов зигот. Первый тип — когда в зиготе трансген располагается в альфа-1-коллагеновом гене хромосом, полученных от матери и от отца. В этом случае эмбрион нежизнеспособен. Во втором и третьем типах трансген находится в альфа-1-коллагеновом гене хромосом только матери или только отца. В четвертом типе хромосомы не содержат трансгена. В последних трех случаях эмбрионы жизнеспособны.
‹
›
Открыть в полном размере
В начале 80-х годов группа ученых США и Швеции впервые получила мышей-великанов. Это был результат введения гена гормона роста крысы в оплодотворенные яйцеклетки мыши.
И выросшая из этого зародыша мышь-великан оказалась почти в два раза больше обычной. Но главный результат опыта заключался в том, что трансгенная мышь росла в два раза быстрее, чем обычная.
Вы можете спросить: зачем нам ускорять рост мышей? Вот если бы куры или коровы росли в короткий срок, то это было бы более полезным для людей.
Действительно, неплохо было бы научиться разводить в сокращенный срок полезных для человека птиц и животных. И эта возможность теперь в перспективе имеется. Более того, уже есть и первые успехи в получении трансгенных животных — таких, как корова, овца и свинья, хотя эти работы пока очень дороги.
Каким же образом удалось ученым ускорить рост мышей? Одним из основных стимуляторов роста и деления клеток у животных и человека является гормон роста. Образуется он обычно в гипофизе. Ученые решили проверить, как будет вести себя чужеродный гормон роста в организме мыши. Структурный ген этого гормона ввели в яйцеклетку. Получили потомство, и оказалось, что гормон крысы вырабатывался в сердце, почках, печени и кишечнике, но не в гипофизе.
При этом количество гормона в крови повышалось в несколько сотен раз по сравнению с нормальными мышами. Очевидно, поэтому некоторые мыши и вырастали великанами.
Такие же манипуляции были проделаны с более отдаленным родственником — геном гормона роста человека. Мыши и в этом случае росли ускоренно. Более того, обнаружился удивительный факт: несмотря на то, что гормон роста человека содержит почти в три раза больше аминокислот, чем гормон роста крысы, это не влияло на усиленный рост мышей — оба гормона действовали с равной силой.
Конечно, здесь еще много сложностей: как обычно, ответы на первые вопросы ставят новые вопросы, и ответа на них пока нет. Но хочется обратить внимание читателей на то, что в крови трансгенных мышей резко увеличивается количество гормона роста. Это открывает возможность использовать трансгенных животных в качестве биологической фабрики гормона роста человека, то есть появляется выход в биотехнологию, способную конкурировать с обычной микробиологической фабрикой.
При этом надо помнить, что мышь — всего лишь объект исследования, а сырьем для биологической фабрики может служить кровь более крупных трансгенных животных (овцы, свиньи, кролика и др.).
Одной из главных проблем биологии, решение которой, пожалуй, не обойдется без использования трансгенных животных, является проблема дифференцировки клеток. В зародыше организма все клетки поначалу одинаковы, но в ходе развития они становятся клетками мышц, костей, нервов, сердца, печени и других органов и тканей. Иными словами, в ходе развития организма клетки получают специальность. Но как именно это происходит, науке пока неизвестно. Проблема между тем громадная и чрезвычайно важная, ибо речь идет о том, чтобы понять суть эмбрионального развития, когда из одной клетки развивается столь сложный организм, как тело млекопитающих и особенно человека.
Еще в начале нашего века эмбриологи экспериментаторы пытались выяснить это с помощью микроманипуляций, разрушая некоторые эмбриональные клетки гонкими иглами или пересаживая участки ткани от одного раннего эмбриона другому.
Подобные методы сохранили свое значение и поныне при изучении пространственной организации клеток, обусловливающей возникновение отдельных органов или тканей. Однако эти методы, как и обычные биохимические методы с использованием очищенных молекул в пробирке, не позволяют сделать прямых выводов относительно молекулярных основ регуляции работы генов,
Для решения проблемы дифференцировки ученые часто используют культуры клеток и тканей. Но ответ на вопрос, какие молекулярные механизмы заставляют клетки дифференцироваться, и на этой модели не получен. Ее недостаток состоит в том, что культивируемые клетки изолированы от организма. У них нет контакта с клетками других тканей, а такой контакт (взаимодействие клеток, обмен сигналами) необходим, ибо он индуцирует дифференцировку и эмбриональное развитие. Вывод напрашивается сам: изучать молекулярные механизмы дифференцировки клеток и раннего эмбрионального развития надо на живом организме. Именно поэтому большие надежды возлагаются на живые модели — трансгенных животных.
Но как эту модель использовать? Напомним, что для получения трансгенных животных нужны гены. Однако для конкретной цели нужны, очевидно, соответствующие ей гены. Какие же из них связаны с дифференцировкой?
В последние годы ученым удалось выявить некоторые гены-регуляторы, которые принимают участие в реализации программы развития организма. Их называют хроногенами, так как, по мнению ученых, они играют основную роль в определении момента начала дифференцирован клеток данного организма.
Наиболее интересные наблюдения были получены при изучении генов, контролирующих пространственную организацию эмбриона плодовой мушки дрозофилы. Оказалось, что многие гены содержат один и тот же сегмент ДНК, названный гомеобоксом, и все они обладают способностью регулировать активность групп других генов. Заметим, что в настоящее время гомеобокс выделен из ДНК многих организмов — от червей до человека.
Нельзя умолчать об онкогенах, которые обнаружены в нормальных клетках большинства организмов (от дрожжей до млекопитающих).
Ученые предполагают, что онкогены не только порождают опухоли, но и участвуют в дифференцировке эмбриональных клеток. Основанием такого предположения послужили некоторые факты. Так, например, было выяснено, что для поддержания роста и деления клеток раннего эмбриона необходимы факторы роста. Но у раннего эмбриона еще нет тканей, способных вырабатывать эти факторы, поэтому можно думать, что каждая клетка раннего эмбриона производит их для самой себя и, возможно, для своего ближайшего окружения. Факторы роста представляют собой белки, кодирующиеся генами. Недавно стало известно, что один из факторов роста кодирует онкоген СИС. Отсюда напрашивается заключение, что онкогены участвуют в раннем развитии эмбриона (более подробно эта проблема изложена в статье В. Дильмана, «Наука и жизнь» №11, 1985).
Итак, ученые имеют сейчас в своем «хозяйстве» ряд замечательных последовательностей ДНК в виде хроногенов, сегмента гомеобокса и онкогенов, которые причастны к дифференцировке клеток в эмбриональном развитии.
Их можно вводить в геном будущих трансгенных животных и изучать их действие во время роста ранних эмбрионов. По-видимому, это дает ключ, который позволит проникнуть в тайны молекулярных механизмов развития высших животных.
Кроме того, введение изолированного онкогена в геном здорового животного дает и другую возможность — изучать отдельно стадии образования опухолей и наследственную предрасположенность к их возникновению. Иными словами, создавать модели течения опухолевых заболеваний. Ведь механизм их образования — процесс очень сложный, многоступенчатый и включает много событий в клетке и организме. Понятно, что для того чтобы разобраться в нем, нужно вычленить отдельные его ступени. Многих ступеней мы еще не знаем. Живая модель — трансгенные животные открывают здесь небывалые перспективы. Поиск механизмов образования опухолей уже ведется и вселяет надежды на успех.
Создание экспериментальных моделей течения болезней открывает новые направления и перед практической медициной, в частности лечением наследственных заболеваний.
В настоящее время насчитывается около трех тысяч наследственных заболеваний. Некоторые из них могут быть следствием нарушения сложных регуляторных систем организма. Большинство же связано с нехваткой ферментов. В качестве примера можно назвать фенилкетонурию, врожденную непереносимость лактозы, подагру, гемолитическую анемию и многие другие.
Терапия таких заболеваний, казалось бы, проста — ввел в организм недостающий фермент и жди улучшения. Однако действует фермент недолго, и приходится делать больному систематические инъекции. Можно использовать ограничение пищевого рациона, чтобы снизить в организме концентрацию вредных веществ. Эти способы довольно успешно используются, но справедливости ради следует сказать, что излечение редко бывает полным. Поэтому в повестку дня встала так называемая генная терапии, то есть методы введения в больные клетки недостающего гена или замены дефектного гена нормальным.
Дело это оказалось непростым. Прежде всего необходимо иметь нормальный ген.
Сейчас их уже научились получать. Для доставки нормального гена в дефектные клетки требуется «повозка». В этой роли ученые решили использовать вирусы. Хотя эта идея не нова, она до последних нескольких лет оставалась нереализованной. Наиболее пригодными оказались опухолевые вирусы, геном которых состоит из РНК (ретровирусы). Эти вирусы отличаются тем, что не убивают клетки подобно другим вирусам. С помощью генной инженерии нужно было превратить исходный вирус в вирус-повозку, функция которого заключалась бы только в доставке нужного гена в клетку и встраивании его в клеточные хромосомы. Молекулярные биологи из Массачусетского технологического института (США) сконструировали такой вирус. Затем «нагрузили» его бактериальным геном устойчивости к антибиотику и ввели эту нагруженную повозку в кроветворные клетки костного мозга мыши. Анализ показал, что все типы клеток крови экспериментальной мыши приобрели этот перенесенный бактериальный ген.
Теоретически этот метод уже можно применить к генотерапии наследственных заболеваний крови людей.
Однако технические проблемы, связанные с регулированием работы перенесенных генов, не позволяют пока это делать. Исследования продолжаются.
Другой способ генотерапии связан с половыми клетками. Группа исследователей использовала его совсем недавно. В качестве объекта они взяли карликовую мышь, которая может служить моделью наследственного заболевания человека. У такой мыши отставание в росте заметно с пятидневного возраста, а взрослые животные достигают приблизительно половины нормальной мыши. Поскольку введение гена гормона роста восстанавливало рост, то ученые решили исправить карликовость с помощью генной терапии. Сначала они вводили в яйцеклетку карликовой мыши чистые гены гормона роста крысы или человека. Рост не восстанавливался. Когда же они ввели в яйцеклетку дополнительно ген-регулятор, то карликовая мышь вырастала до нормальной. Казалось бы, такой успех можно перенести на лечение подобного заболевания у людей. Но придется разочаровать читателей: делать этого пока нельзя.
Причин несколько. Одна из них связана с низкой эффективностью техники гемотерапии. Во-первых, только один процент яйцеклеток с введенным чужим геном развивается в мышь, у которой усилено действие гормона роста. Во-вторых, пока практически невозможно предвидеть, в какое место встроится чужеродная молекула ДНК, и потому-то невозможно гарантированно заменить поврежденный ген нормальным. Более того, вводимый ген может попасть «не туда» и разрушить какой-нибудь нормальный ген, то есть даст результат, обратный желаемому.
Таким образом, эти примеры показывают, что использовать предлагаемые способы для лечения больных людей еще невозможно. Чтобы вмешиваться в наследственность человека, по крайней мере необходимо знать полностью генотип человека. Наука пока далека от этого. Однако первые успехи на этом пути, хотя и очень малые, воодушевляют ученых на дальнейшие поиски.
Наконец, еще одна область возможного использования трансгенных животных — это повышение количества и качества продукции сельскохозяйственных животных.
Так, сам по себе ускоренный рост трансгенных животных, видимо, позволяет увеличить выход мяса. Но, кроме того, есть ведь и возможность (пока теоретическая, конечно) ввести, скажем, в корову ген необходимого продукта и заставить его работать в молочных железах, а продукты гена выделять потом из молока. Со временем люди научатся получать таким образом лекарственные препараты — интерферон, инсулин, гормон роста и другие нужные вещества. Словом, сельскохозяйственные животные смогут нести те или иные конструкции генов и превратятся в живые фабрики биологически и химически важных пептидов и белков.
Все это звучит сейчас слишком фантастично, однако фантазия нередко переходит в реальность. И кто знает, может быть, для людей будущего станут обычными названия специализированных хозяйств — например, совхоз «сахарных» коров, то есть трансгенных коров, молоко которых содержит большое количество сахара.
С другой стороны, техника получения трансгенных животных, видимо, может помочь быстрее переносить полезные свойства одной породы к другой, то есть ускорить выведение новых высокопродуктивных пород животных.
Это откроет невиданные горизонты перед сельскохозяйственной генетикой и селекцией.
Как видим, можно констатировать, что биология вступила в период реального воплощения заветной мечты человечества— направленного изменения высших организмов. Не за горами будущее — конструирование геномов животных и растений.
Однако тут обычно возникает очень серьезный вопрос, интересующий, кстати, многих наших читателей: не опасны ли генноинженерные манипуляции с ДНК для человека, животных и растений? Ведь в результате таких манипуляций могут появиться организмы с совершенно новыми генетическими качествами, ранее не существовавшими на Земле. И если они выйдут каким-либо образом из-под контроля, распространятся в природе, то это может вызвать нежелательные изменения в генетическом аппарате земных организмов — врожденные пороки, уродства и т. п.
Поэтому еще на заре генной инженерии, в середине 70-х годов, группа исследователей обратилась к ученым всего мира с призывом наложить мораторий на генетические эксперименты в наиболее опасных для человека направлениях исследований.
А затем, в феврале 1975 года, в США была созвана международная конференция, на которой присутствовало 140 ученых из 17 стран, в том числе и из Советского Союза. Работе этой конференции стала первым в истории мировой науки примером принятия мер предосторожности до, а не после того, как возникла опасность: на ней был объявлен запрет ни проведение особо опасных экспериментов до разработки соответствующих мер предосторожности.
После конференции исследования по генной инженерии были несколько переориентированы. В качестве объектов для генетических манипуляций были взяты только те микроорганизмы, которые неспособны населять кишечный тракт человека, не выживают в половых клетках и легко уничтожаются обычными моющими средствами.
Затем в нашей стране (так же, как и в других странах) были приняты правила безопасности работ с рекомбинантными (составными) молекулами ДНК. У нас эти правила согласованы с Министерством здравоохранения СССР и ВЦСПС и являются обязательными для всех, имеющих дело с генной инженерией.
В чем же заключаются эти правила? Они, в частности, включают некоторые общие требования безопасности: работу необходимо проводить в специальной одежде и специальными инструментами, не разрешается курить, хранить и принимать пищу в рабочих помещениях, отходы, содержащие рекомбинантные молекулы, помещаются в специальную посуду и обеззараживаются и т. д.
Кроме того, применяются меры физической и биологической защиты различных степеней — в зависимости от величины предполагаемой опасности эксперимента. Так, средний уровень физической защиты (ФЗ) требует проводить эксперименты в лаборатории, имеющей специальные инженерные конструкции, герметичное помещение и защитное оборудование. Воздух из лаборатории выводится по самостоятельным воздуходувам после очистки на фильтрах. Работа с открытыми сосудами, в которых содержится материал с носителем рекомбинантных ДНК, обязательно проводится в боксах с пониженным давлением. Лабораторную одежду нельзя носить вне лаборатории ФЗ, она должна обеззараживаться до отправки в прачечную.
Перед выходом из лаборатории персонал обязан мыть руки с использованием дезинфицирующих средств и т. д.
Высший уровень физической Защиты (Ф4) применяется к работам с микроорганизмами, потенциально опасными для человека, животных и растений. Эксперименты могут проводиться только в помещениях особой конструкции — в отдельном здании или в полностью изолированном от других помещений отсеке общего здания. Инженерные особенности такой лаборатории: монолитные стены, полы и потолки, в которых все технические отверстия (для воздушных каналов, электропроводки, трубопроводных коммуникаций) герметизируются. Лаборатория должна иметь отдельную вентиляционную систему, поддерживающую отрицательное давление воздуха до выхода его в атмосферу, воздушные шлюзы, через которые могут безопасно доставляться в помещение предметы оборудования, посуда, животные и материалы. Вход в лабораторию разрешается только тем лицам, чье присутствие предусмотрено программой исследования. Работы должны выполняться в боксах с вытяжной вентиляцией и фильтрами.
Доступ в эти боксы возможен лишь из рабочих помещений лаборатории.
Важным элементом правил являются биологические меры защиты, разрешающие использовать только такие микроорганизмы, биологические свойства которых исключают их распространение и выживание в окружающей среде. В частности, категорически запрещается использовать для получения рекомбинантных молекул ДНК бактерии и вирусы, патогенные для человека, сельскохозяйственных животных и растений. Тем более не разрешается преднамеренное введение в рекомбинантные молекулы генов, заведомо опасных для здоровья и благополучия человека, и преднамеренное распространение новых рекомбинантных молекул в окружающей среде. (Здесь перечислена, понятно, только часть защитных мер. При желании с ними можно подробней познакомиться в книге «Итоги науки и техники. Молекулярная биология», том 12, часть II, Москва, 1980 г., стр. 199.)
Надо сказать, что со временем — по мере накопления знаний и развития техники генной инженерии — потенциальная опасность подобных экспериментов оказалась преувеличенной, и сейчас правила работы с рекомбинантными молекулами пересматриваются с целью снятия некоторых ограничений.
Это позволит расширить возможности исследований — при прежнем, максимальном уровне езопасности.
Transgene Design — PMC
1. Bates GP, Mangiarini L, Mahal A, Davies SW. Трансгенные модели болезни Гентингтона. Хум Мол Жене. 1997; 6: 1633–1637. doi: 10.1093/hmg/6.10.1633. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
2. Beal MF. Митохондриальная дисфункция при нейродегенеративных заболеваниях. Биохим Биофиз Акта. 1998;1366:211–223. doi: 10.1016/S0005-2728(98)00114-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
3. Gramolini AO, Jasmin BJ. Мышечная дистрофия Дюшенна и нервно-мышечное соединение: атрофиновое звено. Биоэссе. 1997;19:747–750. doi: 10.1002/bies.950190903. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
4. Erickson RP. Мышиные модели генетического заболевания человека: какая мышь больше похожа на человека? Биоэссе. 1996; 18: 993–998. doi: 10.1002/bies.950181209. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
5. Hsiao K, Prusiner SB. Молекулярная генетика и трансгенная модель болезни Гертсмана-Штраусслера-Шейнкера.
Альцгеймер Dis Assoc Disord. 1991; 5: 155–162. doi: 10.1097/00002093-199100530-00001. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
6. Ливитт Б.Р., Веллингтон К.Л., Хейден М.Р. Недавнее понимание молекулярного патогенеза болезни Гентингтона. Семин Нейрол. 1999; 19: 385–395. doi: 10.1055/s-2008-1040853. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
7. Mehler MF. Мозговой дистрофин, нейрогенетика и умственная отсталость. Res Brain Res Rev. 2000; 32: 277–307. doi: 10.1016/S0165-0173(99)00090-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
8. Choi T, Huang M, Gorman C, Jaenisch R. Общий интрон увеличивает экспрессию генов у трансгенных мышей. Мол Селл Биол. 1991;11:3070–3074. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
9. Aronow BJ, Silbiger RN, Dusing MR, Stock JL, et al. Функциональный анализ регуляторной области тимуса гена аденозиндезаминазы человека и ее способности генерировать позиционно-независимую экспрессию трансгена. Мол Селл Биол. 1992; 12:4170–4185. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
10.
Betz AG, Milstein C, Gonzalez-Fernandez A, Pannell R, et al. Элементы, регулирующие соматическую гипермутацию гена каппа иммуноглобулина: критическая роль области прикрепления интронного энхансера/матрикса. Клетка. 1994;77:239–248. doi: 10.1016/0092-8674(94)90316-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
11. Brooks AR, Nagy BP, Taylor S, Simonet WS, et al. Последовательности, содержащие энхансер второго интрона, необходимы для транскрипции гена аполипопротеина В человека в печени трансгенных мышей. Мол Селл Биол. 1994; 14:2243–2256. doi: 10.1128/MCB.14.4.2243. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
12. Charron G, Guy LG, Bazinet M, Julien JP. Множественные нейрон-специфические энхансеры в гене, кодирующем легкую цепь нейрофиламента человека. Дж. Биол. Хим. 1995;270:30604–30610. doi: 10.1074/jbc.270.51.30604. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
13. Dale TC, Krnacik MJ, Schmidhauser C, Yang CL, et al. Высокий уровень экспрессии гена крысиного сывороточного кислого белка опосредуется элементами в промоторе и 3′-нетранслируемой области.
Мол Селл Биол. 1992; 12: 905–914. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
14. Krnacik MJ, Li S, Liao J, Rosen JM. Позиционно-независимая экспрессия трансгенов сывороточного кислого белка. Дж. Биол. Хим. 1995;270:11119–11129. doi: 10.1074/jbc.270.19.11119. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
15. Li Q, Harju S, Peterson KR. Регионы контроля локуса: взросление в десятилетие с лишним. Тенденции Жене. 1999; 15: 403–408. doi: 10.1016/S0168-9525(99)01780-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
16. Liska DJ, Reed MJ, Sage EH, Bornstein P. Клеточно-специфическая экспрессия минигенов альфа-1(I) коллагена-hGH у трансгенных мышей. Джей Селл Биол. 1994; 125: 695–704. doi: 10.1083/jcb.125.3.695. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
17. Zimmerman L, Parr B, Lendahl U, Cunningham M, et al. Независимые регуляторные элементы в гене нестина направляют экспрессию трансгена в нейральные стволовые клетки или предшественники мышц. Нейрон.
1994; 12:11–24. doi: 10.1016/0896-6273(94)
18. Козак М. По крайней мере шесть нуклеотидов, предшествующих кодону инициатора AUG, усиливают трансляцию в клетках млекопитающих. Дж Мол Биол. 1987; 196: 947–950. doi: 10.1016/0022-2836(87)90418-9. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
19. Manson AL, Trezise AE, MacVinish LJ, Kasschau KD, et al. Комплементация мышей с нулевым CF человеческим трансгеном CFTR YAC. EMBO J. 1997; 16: 4238–4249. doi: 10.1093/emboj/16.14.4238. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
20. Sun T, Jayatilake D, Afink GB, Ataliotis P, et al. Трансген YAC человека восстанавливает развитие черепно-лицевой области и нервной трубки у мышей с нокаутом PDGFR-альфа и раскрывает роль PDGFR-альфа в пренатальном росте легких. Разработка. 2000;127:4519–4529. [PubMed] [Google Scholar]
21. Hodgson JG, Agopyan N, Gutekunst CA, Leavitt BR, et al. Мышиная модель YAC для болезни Хантингтона с полноразмерным мутантным гентингтином, цитоплазматической токсичностью и селективной полосатой нейродегенерацией.
Нейрон. 1999; 23: 181–192. doi: 10.1016/S0896-6273(00)80764-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
22. Schedl A, Montoliu L, Kelsey G, Schutz G. Искусственная хромосома дрожжей, покрывающая ген тирозиназы, обеспечивает экспрессию, зависящую от числа копий, у трансгенных мышей. Природа. 1993;362:258–261. дои: 10.1038/362258a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
23. Vassaux G, Manson AL, Huxley C. Зависимая от числа копий экспрессия YAC-клонированного человеческого гена CFTR в эпителиальной клеточной линии человека. Джин Тер. 1997; 4: 618–623. doi: 10.1038/sj.gt.3300442. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
24. Palmiter RD, Norstedt G, Gelinas RE, Hammer RE, et al. Слитые гены металлотионеина и ГР человека стимулируют рост мышей. Наука. 1983; 222: 809–814. doi: 10.1126/science.6356363. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
25. Heisterkamp N, Jenster G, ten Hoeve J, Zovich D, et al. Острый лейкоз у трансгенных мышей bcr/abl. Природа. 1990; 344: 251–253.
doi: 10.1038/344251a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
26. Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, et al. Драматический рост мышей, которые развиваются из яиц, которым микроинъецировали гены слияния металлотионеина и гормона роста. Природа. 1982; 300: 611–615. doi: 10.1038/300611a0. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
27. Бринстер Р.Л., Палмитер Р.Д. Трансгенные мыши, содержащие слитые гены гормона роста. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1984; 307: 309–312. doi: 10.1098/rstb.1984.0132. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
28. Brinster RL, Chen HY, Trumbauer M, Senear AW, et al. Соматическая экспрессия тимидинкиназы герпеса у мышей после инъекции слитого гена в яйца. Клетка. 1981; 27: 223–231. doi: 10.1016/0092-8674(81)90376-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
29. Palmiter RD, Wilkie TM, Chen HY, Brinster RL. Искажение передачи и мозаицизм в необычной родословной трансгенных мышей.
Клетка. 1984; 36: 869–877. doi: 10.1016/0092-8674(84)
-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
30. Ghoshal K, Jacob ST. Регуляция экспрессии гена металлотионеина. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2000;66:357–384. doi: 10.1016/S0079-6603(00)66034-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
31. Фишман Г.И. Время решает все в жизни: условная экспрессия трансгена в сердечно-сосудистой системе. Цирк Рез. 1998;82:837–844. [PubMed] [Google Scholar]
32. Chin L, DePinho RA. Переключение онкогенного выключателя: освещение сохранения и регрессии опухоли. Тенденции Жене. 2000; 16: 147–150. doi: 10.1016/S0168-9525(99)01968-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
33. Gardner DP, Byrne GW, Ruddle FH, Kappen C. Пространственная и временная регуляция репортерного трансгена lacZ в бинарной системе трансгенных мышей. Трансгенный Рез. 1996; 5:37–48. doi: 10.1007/BF01979920. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
34. Furth PA, St Onge L, Boger H, Gruss P, et al. Временный контроль экспрессии генов у трансгенных мышей с помощью промотора, чувствительного к тетрациклину.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91:9302–9306. doi: 10.1073/pnas.91.20.9302. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
35. Jaisser F. Индуцибельная экспрессия генов и модификация генов у трансгенных мышей. J Am Soc Нефрол. 2000; 11 (Приложение 16): S95–S100. [PubMed] [Google Scholar]
36. St-Onge L, Furth PA, Gruss P. Временный контроль рекомбиназы Cre у трансгенных мышей с помощью промотора, чувствительного к тетрациклину. Нуклеиновые Кислоты Res. 1996;24:3875–3877. doi: 10.1093/нар/24.19.3875. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
37. Shockett P, Difilippantonio M, Hellman N, Schatz DG. Модифицированная регулируемая тетрациклином система обеспечивает авторегуляторную, индуцируемую экспрессию генов в культивируемых клетках и трансгенных мышах. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:6522–6526. doi: 10.1073/pnas.92.14.6522. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
38. Zhao B, Magdaleno S, Chua S, Wang YL, et al.
Модели трансгенных мышей рака легких. Exp Lung Res. 2000; 26: 567–579.. doi: 10.1080/010150216675. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
39. Scrable H, Stambrook PJ. Генетическая программа удаления чужеродной ДНК из генома млекопитающих. Мутат рез. 1999; 429: 225–237. doi: 10.1016/S0027-5107(99)00114-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
40. Доерфлер В. Паттерны метилирования ДНК – эволюционные остатки инактивации чужеродной ДНК как защитного механизма хозяина. Предложение. Биол Хим Хоппе Сейлер. 1991; 372: 557–564. дои: 10.1515/bchm3.1991.372.2.557. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
41. Clark AJ, Harold G, Yull FE. кДНК млекопитающих и репортерные последовательности прокариот замалчивают соседние трансгены у трансгенных мышей. Нуклеиновые Кислоты Res. 1997; 25:1009–1014. doi: 10.1093/нар/25.5.1009. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
42. Мартин Д.И., Уайтлоу Э. Капризы пестрых трансгенов. Биоэссе. 1996; 18: 919–923.
doi: 10.1002/bies.950181111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
43. Henikoff S. Заговор молчания среди повторяющихся трансгенов. Биоэссе. 1998;20:532–535. doi: 10.1002/(SICI)1521-1878(199807)20:7<532::AID-BIES3>3.0.CO;2-M. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
44. Гаррик Д., Фиеринг С., Мартин Д.И., Уайтлоу Э. Индуцированное повторами молчание генов у млекопитающих. Нат Жене. 1998; 18:56–59. doi: 10.1038/ng0198-56. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
8.8: Трансгенные организмы — Биология LibreTexts
- Последнее обновление
- Сохранить как PDF
- Идентификатор страницы
- 4114
- Тодд Никл и Изабель Барретт-Нг
- Mount Royal University & University of Calgary 9 0100
Общие принципы трансгенеза
Трансгенные организмы содержат чужеродную ДНК, введенную с помощью биотехнологии.
Чужеродная ДНК ( трансген ) определяется здесь как ДНК другого вида или же рекомбинантная ДНК того же вида, с которой манипулировали в лаборатории, а затем повторно ввели. Термины трансгенный организм и генетически модифицированный организм ( ГМО ) обычно являются синонимами. Процесс создания трансгенных организмов или клеток, которые станут целыми организмами с необратимым изменением их зародышевой линии, был назван либо трансформацией , либо трансфекцией . (К сожалению, оба слова имеют альтернативные значения. Трансформация также относится к процессу превращения клетки млекопитающего в раковую, в то время как трансфекция также относится к процессу введения ДНК в культуру клеток, бактериальных или эукариотических, для временного использования, а не к изменениям зародышевой линии. .) Трансгенные организмы являются важным инструментом исследования и часто используются при изучении функции гена. Трансгенез также связан с медицинской практикой генной терапии, при которой ДНК переносится в клетки пациента для лечения болезни.
Трансгенные организмы широко распространены в сельском хозяйстве. Примерно 90% рапса, хлопка, кукурузы, сои и сахарной свеклы, выращиваемых в Северной Америке, являются трансгенными. В настоящее время в Северной Америке не производится никакой другой трансгенный скот или сельскохозяйственные культуры (за исключением некоторых тыкв, папайи и люцерны).
Чтобы получить трансгенную клетку, ДНК должна быть сначала перенесена через клеточную мембрану (и, если она присутствует, через клеточную стенку), не разрушая клетку. В некоторых случаях «голая» ДНК (имеется в виду плазмидная или линейная ДНК, которая не связана ни с каким типом носителя ) может быть перенесена в клетку путем добавления ДНК в среду и временного увеличения пористости мембраны, например, путем электропорация . При работе с более крупными клетками «голая» ДНК также может быть микроинъецирована в клетку с помощью специальной иглы. Другие методы используют вектора для транспорта ДНК через мембрану.
Обратите внимание, что используемое здесь слово «вектор» относится к любому типу носителя, а не только к плазмидным векторам. Векторы для трансформации/трансфекции включают везикулы , сделанные из липидов или других полимеров, которые окружают ДНК; различные типы частиц, несущих на своей поверхности ДНК; и инфекционные вирусы и бактерии, которые естественным образом переносят свою собственную ДНК в клетку-хозяин, но которые были сконструированы для переноса любой представляющей интерес молекулы ДНК. Обычно чужеродная ДНК представляет собой полную экспрессионную единицу, включающую собственные цис-регуляторы (например, промотор), а также ген, подлежащий транскрибированию.
Если целью эксперимента является получение стабильного (т. е. наследуемого) трансгенного эукариота, чужеродная ДНК должна быть включена в хромосомы хозяина. Чтобы это произошло, чужеродная ДНК должна проникнуть в ядро хозяина и рекомбинировать с одной из хроматид хозяина.
У некоторых видов чужеродная ДНК встраивается в случайное место хроматиды, вероятно, там, где происходит разрыв цепи и негомологичное соединение концов. У других видов чужеродная ДНК может быть нацелена на определенный локус путем фланкирования чужеродной ДНК ДНК, гомологичной ДНК хозяина в этом локусе. Затем чужеродная ДНК встраивается в хромосомы хозяина посредством гомологичной рекомбинации.
Кроме того, для получения многоклеточных организмов, в которых все клетки являются трансгенными и трансген стабильно наследуется, первоначально трансформированная клетка должна быть либо гаметой, либо должна развиться в ткани, продуцирующие гаметы. Трансгенные гаметы в конечном итоге могут быть скрещены для получения гомозиготного трансгенного потомства. Присутствие трансгена в потомстве обычно подтверждается с помощью ПЦР или Саузерн-блоттинга, а экспрессию трансгена можно измерить с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), РНК-блоттинга и Вестерн-блоттинга (белкового блоттинга).
Скорость транскрипции трансгена сильно зависит от состояния хроматина, в который он вставлен (т.е. позиционные эффекты ), а также от других факторов. Поэтому исследователи часто создают несколько независимо трансформированных/трансфицированных линий с одним и тем же трансгеном, а затем проводят скрининг линий с наивысшей экспрессией. Также рекомендуется клонировать и секвенировать трансгенный локус из вновь созданного трансгенного организма, поскольку во время трансформации/трансфекции могут быть внесены ошибки (усечения, перестройки и другие мутации).
Получение трансгенного растения
Наиболее распространенным методом получения трансгенных растений является Опосредованная агробактериями трансформация (рис. \(\PageIndex{1}\)). Agrobacterium tumifaciens представляет собой почвенную бактерию, которая в рамках своего естественного патогенеза вводит свою собственную индуцирующую опухоль ( T i ) плазмиду в клетки растения-хозяина.
Природная плазмида T i кодирует гены, стимулирующие рост, которые вызывают образование галла (то есть опухоли) на растении, что также обеспечивает среду для размножения патогена. Молекулярные биологи разработали T i путем удаления генов, индуцирующих опухоль, и добавления сайтов рестрикции, что делает удобным вставку любой интересующей ДНК. Эта сконструированная версия называется плазмидой Т-ДНК (трансфер-ДНК); бактерия переносит линейный фрагмент этой плазмиды, который включает консервативные последовательности ДНК «левая граница (LB)» и «правая граница (RB)», а также все, что находится между ними (примерно до 10 т.п.н.). Фрагмент линейной Т-ДНК транспортируется в ядро, где рекомбинирует с ДНК хозяина, вероятно, везде, где в хромосомах хозяина происходят случайные разрывы.
Бактериальную культуру и растительную ткань (например, пуансон из листьев) совместно культивируют на питательной среде в чашке Петри. Некоторые из растительных клеток будут инфицированы бактерией, которая перенесет Т-ДНК в цитоплазму растения. В некоторых случаях трансген интегрируется в хромосомную ДНК растительной клетки. В присутствии определенных комбинаций гормонов растительные клетки дедифференцируются в массу клеток, называемую каллюсом. Присутствие селективного агента (например, гербицида или антибиотика) в питательной среде предотвращает деление нетрансформированных клеток. Следовательно, каждый каллус в идеале состоит только из трансгенных растительных клеток. Устойчивые каллусы переносят на среды с другими комбинациями гормонов, которые способствуют органогенезу, т. е. дифференцировке клеток каллюса в побеги, а затем в корни. Регенерированные трансгенные растения переносят в почву. Их семена можно собрать и протестировать, чтобы убедиться, что трансген стабильно наследуется.
(Оригинал-Deyholos-CC:AN) Цветки арабидопсиса и некоторых других видов можно просто окунуть в суспензию Agrobacterium, и ~1% полученных семян будет трансформирован. У большинства других видов растений клетки под действием гормонов образуют массу недифференцированных тканей, называемую каллюсом. Agrobacterium наносят на каллюс и трансформируют несколько клеток, которые затем могут быть вызваны другими гормонами для регенерации целых растений (рис. \(\PageIndex{2}\)). Некоторые виды растений устойчивы (например, « непокорные «) к трансформации Agrobacterium. В этих ситуациях необходимо использовать другие методы, такие как бомбардировка частицами , при которой ДНК нековалентно прикрепляется к небольшим металлическим частицам, которые ускоряются сжатым воздухом в каллусной ткани, из которой иногда можно регенерировать целые трансгенные растения. Во всех методах трансформации наличие селектируемого маркера (например, гена, придающего устойчивость к антибиотикам или гербицидам) полезно для отличия трансгенных клеток от нетрансгенных клеток на ранней стадии процесса трансформации.
Получение трансгенной мыши
В широко используемом методе получения трансгенной мыши стволовые клетки удаляют из эмбриона мыши, а конструкцию трансгенной ДНК переносят в стволовую клетки с помощью электропорации, и часть этой трансгенной ДНК попадает в ядро, где она может подвергнуться гомологичной рекомбинации (рис. \(\PageIndex{3}\)). Трансгенная ДНК-конструкция содержит ДНК, гомологичную по обе стороны от локуса, на который должна быть направлена замена. Если цель эксперимента — просто удалить (« нокаут ») целевого локуса, ДНК хозяина можно просто заменить селектируемым маркером, как показано. Также возможно заменить ДНК хозяина в этом локусе другой версией того же гена или совершенно другим геном, в зависимости от того, как сделана трансгенная конструкция. Клетки, которые были трансфицированы и экспрессируют селектируемый маркер (т.е. устойчивость к устойчивости к антибиотику неомицину, в данном примере neoR), отличаются от неудачно трансфицированных клеток своей способностью выживать в присутствии селективного агента (например, антибиотика).
Затем трансфицированные клетки вводят эмбрионам на ранних стадиях развития, а затем передают приемной матери. Полученные щенки являются химерами, а это означает, что только некоторые из их клеток являются трансгенными. Некоторые из химер будут производить трансгенные гаметы, которые при скрещивании с гаметами дикого типа будут давать мышей, гемизиготных по трансгену. В отличие от химер, эти гемизиготы несут трансген во всех своих клетках. Путем дальнейшего разведения можно получить мышей, гомозиготных по трансгену.
Эти устойчивые к неомицину клетки затем трансплантируют другому эмбриону, который вырастет в химеру внутри приемной матери. (Wikipedia-Kiaergaard-CC:AN)Генная терапия человека
Многие различные стратегии генной терапии человека находятся в стадии разработки. Теоретически для трансфекции могут быть использованы зародышевые клетки или соматические клетки , но большинство исследований сосредоточено на трансфекции соматических клеток из-за рисков и этических проблем, связанных с трансформацией зародышевой линии. Подходы генной терапии могут быть дополнительно классифицированы как ex vivo или in vivo , где первое означает, что клетки (например, стволовые клетки) трансфицируют изолированно перед введением в организм, где они заменяют дефектные клетки. Генная терапия Ex vivo для лечения ряда заболеваний крови (например, иммунодефицита, талассемии) проходит клинические испытания.
Для терапии in vivo трансфекция происходит внутри пациента. Целью может быть как стабильная интеграция, так и неинтегративная трансфекция. Как описано выше, стабильная трансфекция предполагает интеграцию в геном хозяина. В клиническом контексте стабильная интеграция может не понадобиться, и она сопряжена с более высоким риском индуцирования мутаций как в трансгене, так и в геноме хозяина). Напротив, временная трансфекция не включает интеграцию в геном хозяина, и поэтому трансген может быть доставлен в клетку либо в виде РНК, либо в виде ДНК. Преимущества доставки РНК заключаются в том, что для управления экспрессией трансгена не требуется промоутер. Помимо трансгенов мРНК, которые могли бы обеспечить функциональную версию мутантного белка, большой интерес представляет доставка siRNA (малые ингибиторные РНК), которые можно использовать для подавления определенных генов в геноме клетки-хозяина.
Векторы для генной терапии in vivo должны быть способны доставлять ДНК или РНК в большую часть клеток-мишеней, не вызывая значительного иммунного ответа или оказывая какое-либо токсическое действие.
В идеале векторы также должны обладать высокой специфичностью в отношении целевого типа клеток. Векторы на основе вирусов (например, лентивирусы ) разрабатываются как в in vivo и ex vivo генная терапия. Другие невирусные векторы (например, везикулы и наночастицы) также разрабатываются для генной терапии.
Эта страница под названием 8.8: Трансгенные организмы распространяется под лицензией CC BY-SA 3.0 и была создана, изменена и/или курирована Тоддом Никлом и Изабель Барретт-Нг посредством исходного контента, который был отредактирован в соответствии со стилем и стандартами Платформа LibreTexts; подробная история редактирования доступна по запросу.
- Наверх
- Была ли эта статья полезной?
- Тип изделия
- Раздел или Страница
- Автор
- Тодд Никл и Изабель Барретт-Нг
- Лицензия
- СС BY-SA
- Версия лицензии
- 3,0
- Показать оглавление
- нет
- Теги
- генная терапия
- источник@http://opengenetics.
