Чсв в вк: Что значит ЧСВ в вконтакте. Как переводится и расшифровывается

границ | Клеточное программирование HSV-2 делает возможным продуктивную ВИЧ-инфекцию в дендритных клетках

Введение

Инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), — это заболевание, передающееся половым путем, от которого, по сообщениям, страдают почти 37 миллионов человек во всем мире (1). Риск заражения ВИЧ-1 во время полового акта в три раза выше для лиц, инфицированных вирусом простого генитального герпеса 2 типа (ВПГ-2) (2, 3), и наибольший риск наблюдается у лиц, которые столкнулись с ВПГ-2 недавно (4).Многие люди с серопозитивной реакцией на ВПГ-2 не знают о своем инфекционном статусе, а выделение вируса и эпителиальные микроязвы, как известно, часто возникают у бессимптомных лиц. Более того, данные указывают на то, что противовирусное лечение не может полностью подавить инфекцию HSV-2 (5–7). Присутствие как ВИЧ-1, так и ВПГ-2 создает среду, в которой иммунные клетки, такие как дендритные клетки (ДК) и клетки Лангерганса (ЖК), могут подвергаться воздействию вирусов или вирусных факторов и обусловливаться ими.Интересно, что присутствие как HSV-2, так и HIV-1, по-видимому, в несколько раз увеличивает уровни ДНК ВИЧ в DC (8), LC (9) и макрофагах (10).

Усиление ВИЧ-инфекции за счет присутствия ВПГ-2, по-видимому, имеет несколько объяснений, включая микросреду, обусловленную инфильтрацией и персистенцией ВПГ-2-специфических CD4 + Т-клеток в слизистой оболочке (11). CD4 + Т-клетки из-за их экспрессии α4β7 + особенно восприимчивы к ВИЧ-инфекции (12–14). Кроме того, повышенная инфильтрация миелоидных ДК и плазмоцитоидных ДК (12), вероятно, способствует усилению инфекции слизистой оболочки за счет привлечения дополнительных клеток-мишеней ВИЧ.Причина усиления инфекции, помимо большего количества присутствующих иммунных клеток, может быть связана с активацией ДК, расположенных в слизистой оболочке (15). Активированные DC продуцируют высокие уровни TNF, которые обусловливают микроокружение, а также соседние DC и Т-клетки, делая их более восприимчивыми к инфекции ВИЧ-1 за счет увеличения их экспрессии CCR5 (8). Кроме того, HSV-2 может также предварительно кондиционировать DC и Т-клетки, обеспечивая патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP), что приводит к усилению ВИЧ-инфекции.

Микроокружение в очаге инфекции обогащено множеством растворимых факторов, которые могут влиять на инфицирование ВИЧ-1 и ВПГ-2, включая компоненты системы комплемента (16–18). Вирионы ВИЧ-1 защищены от нормального лизиса, опосредованного комплементом, благодаря включению молекул, ингибирующих комплемент, таких как CD55 и CD59, в их липидную мембрану (19), что приводит к опсонизации частиц ВИЧ-1 инактивированными фрагментами комплемента, такими как iC3b и C3d (20–22).Кроме того, вирионы, передаваемые во время половой передачи, должны быть комплементарными и / или комплементарными частицами, опсонизированными антителами, видимыми при контакте с семенной жидкостью и / или секрециями шейки матки (19). Считается, что оба вируса используют это звено врожденного иммунного аппарата для усиления тяжести инфекции и избегания комплемент-опосредованного лизиса вирионов (18, 20, 21, 23).

Активация врожденного иммунитета является важным компонентом механизмов противовирусной защиты. Пока что известно значительно меньше о врожденном клеточном программировании, генерируемом HSV-2 в DC, которое может способствовать развитию ВИЧ-инфекции.И HSV-2, и ВИЧ распознаются множеством рецепторов распознавания образов (PRR) в организме хозяина. Ранее было показано, что Toll-подобный рецептор (TLR) 2, TLR3, TLR9 и некоторые внутрицитоплазматические сенсоры, такие как отсутствующие в меланоме 2 (AIM2), интерферон-гамма-индуцибельный белок 16 (IFI16) и белок 5 (MDA5), связанный с дифференцировкой меланомы, для распознавания HSV в различных типах клеток мыши и / или человека (24, 25). Раннее распознавание HSV-1 в первичных клетках человека, например макрофагах, включает два внутриклеточных пути восприятия нуклеотидов для индукции IFN типа I и воспалительных факторов.MDA5 / MAVS играет первостепенную роль в индукции IFN типа I, тогда как путь TLR2, по-видимому, играет менее важную роль в ранних врожденных ответах (24). Недавние открытия установили участие врожденных сенсоров IFI16 и cGMP-AMP-синтазы (cGAS) в защите хозяина от ДНК-вирусов, таких как HSV (26). Восприятие IFI16 ДНК ВПГ активирует инфламмасомный аппарат и ответы IFN-β в некоторых типах клеток (26). В фибробластах, инфицированных HSV-1, ДНК HSV-1 воспринимается как IFI16, так и cGAS (27).IFI16 и cGAS стимулируют путь STING, что приводит к активации TBK1 и IRF3, что приводит к продукции IFN-β (28). ВИЧ-1 распознается TLR, RIG-1-подобными рецепторами, NOD2, IFI16 и cGAS (29–31). Мы обнаружили, что передача сигналов в ВИЧ-инфицированных ДК, происходящих из моноцитов человека, включает путь TLR8 с последующей активацией сигнальных каскадов p38 MAPK, ERK, NF-κB, IRF1 и IRF7, тогда как опсонизированные комплементом вирионы обладают способностью подавлять эти и активируют сигнальные пути Lyn, PI3K, IRF3 (20).

В свете повышенной распространенности ВИЧ-инфекции и выделения вируса на слизистую оболочку половых органов у серопозитивных людей по ВПГ-2 (2, 3, 5–7), а также того факта, что ДК становятся мишенью ВИЧ-1 во время передачи половым путем, мы стремились расшифровать ВПГ-2 индуцировал клеточное программирование, лежащее в основе усиленного инфицирования ДК ВИЧ-1. Предварительное кондиционирование человеческих DC HSV-2 перед воздействием ВИЧ-1 увеличивало воспалительные и противовирусные реакции, а также уровень ВИЧ-инфекции в DC. Мы обнаружили, что множественные сигнальные пути активируются на уровне транскрипции как в свободных, так и в опсонизированных комплементом DCs, подвергнутых воздействию HSV-2 / HIV-1.Усиление инфицирования ВИЧ-1 зависело от активации пути STING и требовало распознавания структурно интактной ДНК HSV-2. Кондиционирование HSV-2, как свободным, так и опсонизированным комплементом, в двойно экспонированных DC снижает уровни белков IFI16, cGAS, TBK1 и IRF3, которые все участвуют в пути STING. Кроме того, активация пути STING в DC, инфицированных HSV-2 / HIV-1, привела к снижению уровней некоторых факторов рестрикции ВИЧ, например SAMHD1, TREX1 и APOBEC3G, что уменьшило их клеточное ограничение инфекции ВИЧ-1 в DC.Наша работа продемонстрировала, что перепрограммирование, опосредованное ВПГ-2, увеличивает способность ВИЧ инфицировать ДК и создает благоприятную микросреду для инфицирования и передачи ВИЧ.

Материалы и методы

Реагенты

DC RPMI1640 (GIBCO, Швеция) добавляли 2 мМ глутамина, 20 мкг / мл гентамицина (GIBCO), 10 мМ HEPES (GIBCO) и 1% человеческой плазмы. Рекомбинантный человеческий GM-CSF (Genzyme) (100 Ед / мл) и 300 Ед / мл рекомбинантный человеческий IL-4 (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) использовали для размножения DC in vitro .

ДК, полученные из моноцитов, и культура клеток THP1

Брали цельную кровь здоровых добровольцев или лейкоцитарную пленку из банка крови университетской больницы Линчёпинга (этические разрешения M173-07 и M75-08 / 2008). Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) разделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) и инкубировали на чашках для культивирования клеток (BD, Европа) в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы обеспечить прилипание Предшественники DC и возможность отбрасывать неприлипающие клетки.Предшественники были дифференцированы в незрелые ДК, происходящие из моноцитов (далее называемые незрелыми ДК), путем добавления 100 ед. / Мл GM-CSF и 300 ед. / Мл IL-4 на 0, 2 и 4 день культивирования. После этого DC оценивали на экспрессию маркеров CD14 и CD83 в качестве контроля качества перед использованием в экспериментах. В некоторых экспериментах использовали клетки THP1 дикого типа или THP1-Dual ™ KO-STING (Invivogen, Франция). Клетки THP1 культивировали в соответствии с инструкциями производителя, активировали, используя форбол 12-миризат 13-ацетат (PMA, 10 мкг / мл), и инкубировали за 2 дня до инфицирования клеток и обрабатывали таким же образом, как описано ниже для DC.

Распространение и титрование вирусов

HSV-2, исходный вирусный материал готовили в клетках почки африканской зеленой мартышки (GMK), культивируемых в DMEM с добавлением 10% инактивированной нагреванием (HI) FCS, как описано ранее (32). Штамм 333 HSV-2 использовали либо как инфекционный, либо как γ-облученный (30 мин) инактивированный вирус. ВИЧ-1BaL / SUPT1-CCR5 CL.30 (партии 4235, 4238, 4313 и 4366) получали с использованием хронически инфицированных культур линии клеток ACVP / BCP (№ 204), первоначально полученных путем инфицирования SUPT1-CCR5 CL.30 клеток (щедро подаренных доктором Дж. Хокси из Пенсильванского университета) с инфекционным запасом ВИЧ-1BaL (Программа исследований и эталонных реагентов NIH AIDS, Каталожный № 416, Лот № 59155). Вирус очищали и концентрировали, как описано ранее (33), и аликвоты замораживали. Все вирусные препараты проверяли на инфекционность.

Поколение GFP Reporter CCR5-Tropic Virus

Провирусная конструкция NLENG1-IRES была использована для создания NLENG1-IRES-70 путем замены ENV на YU-2 ENV, как описано в другом месте (34, 35).Провирусная конструкция была щедро пожертвована доктором Дэвидом Н. Леви (Нью-Йоркский университет, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США). Клетки HEK-293T культивировали в среде DMEM, содержащей 10% HI FCS, и при ~ 70% конфлюентности клетки трансфицировали провирусной конструкцией NLENG1-IRES-70 с использованием метода CaPO ₄ . После 8 ч трансфекции среду заменяли DMEM с добавлением 1% HI FCS. GFP-HIV собирали на следующий день, собирая супернатант, и остатки клеток удаляли осаждением при 2500 об / мин в течение 5 минут.Запасы вируса разделяли на аликвоты и замораживали при -80 ° C.

Опсонизация ВПГ-2 и ВИЧ

Комплементарная опсонизация HSV-2, ВИЧ и GFP-HIV была проведена путем инкубации вирионов с равным объемом человеческой сыворотки (HS) (этические разрешения M173-07 и M75-08 / 2008). Для опсонизации использовались разные HS; Серонегативный HSV-1 и HSV-2 был использован для опсонизации вируса HSV-2 (обозначаемого как CHSV), а серонегативный HS-ВИЧ и HSV-2 был использован для опсонизации вирусов ВИЧ-1 или GFP-HIV-1 (называемых CHIV. и CHIV-GFP).HS был протестирован на антитела к HSV с использованием наборов HerpeSelect ^® 1 ELISA IgG и HerpeSelect ^® 2 ELISA IgG (Focus Diagnostics, Cypress, CA, USA). Свободные вирусы HSV-2, HIV-1 и GFP-HIV-1 (называемые HSV, HIV и GFP-HIV) разводили до той же концентрации опсонизированного вируса. Отрицательный контроль, т.е. имитация, обрабатывали культуральной средой. Все вирусные группы инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C и использовали в экспериментах по коинфекции.

Инфекция ВПГ-2 и ВИЧ среди ДК

незрелых DC (10 ⁶ клеток / мл) были инфицированы ложным, (30 нг / мкл) ВИЧ или CHIV как единичная инфекция.ВИЧ / HSV или CHIV / CHSV использовались в двух схемах: прямая и отсроченная коинфекция. В отсроченной группе 1 MOI HSV-2 и CHSV добавляли к DC в течение 2 часов, а затем клетки промывали перед добавлением ВИЧ и CHIV в течение 4, 6 или 22 часов. В установке прямого совместного инфицирования оба типа вируса добавляли к DC одновременно в течение 3 часов, промывали и затем инкубировали еще 21 час во всех установках. DC культивировали в среде 1% плазмы человека. ДК собирали, промывали и лизировали лизисным буфером Bioline RLY (Bioline, UK) для экстракции РНК или фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 10 минут при 4 ° C для иммунного фенотипа с помощью проточной цитометрии.

Чтобы изучить уровень продуктивной ВИЧ-инфекции, были выполнены две схемы коинфекции, и супернатанты были собраны на 1, 4, 7 и 10 день. После сбора супернатанта клетки повторно суспендировали в 10% FBS перед добавлением IL-4 и GM-CSF. Уровень p24 ВИЧ определяли с помощью внутреннего анализа ELISA на p24 (36). Кроме того, продуктивная ВИЧ-инфекция оценивалась с использованием репортерного CCR5-тропного вируса GFP с использованием тех же экспериментальных установок, которые описаны ранее для других вирусов.DC инфицировали GFP-HIV в течение 3 и 5 дней перед тем, как процент положительных клеток GFP анализировали с помощью проточной цитометрии.

Экстракция тотальной РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР

Суммарную РНК из ДК, подвергнутых различным условиям, экстрагировали с использованием коммерческого набора Isolate II RNA Mini или Micro (Bioline, UK), а общую кДНК получали с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Количественную оценку транскриптов генов проводили с использованием набора SensiFAST SYBR ^® Hi-ROX (Bioline, UK) и системы CFX96 Touch Real-Time (BIO-RAD Inc.). Праймеры, нацеленные на β-актин и GAPDH, использовали в качестве генов домашнего хозяйства для справки, как описано другими (37). Праймеры были закуплены у CyberGene AB (Стокгольм, Швеция). Чтобы компенсировать различия между пластинами, значения были нормализованы, как описано ранее (38).

ELISA и цитометрический набор шариков

Уровни белков TNF (Mabtech, Швеция) и IFN-β (набор VeriKine; PBL Assay Science, США) оценивали в супернатантах культур DC примерно через 20 ч инфицирования с помощью ELISA согласно протоколам производителей.Наборы цитометрических шариков (BD Biosciences, Стокгольм, Швеция) использовали для измерения уровней цитокинов и хемокинов в клеточных супернатантах и ​​для измерения уровней фосфорилированного белка в лизатах DC (BD Biosciences, Стокгольм, Швеция) в соответствии с протоколами производителя.

Проточная цитометрия

Качество незрелых DC оценивали путем окрашивания PE-конъюгированными антителами против CD83 и CD14 человека (BD, Европа). DC использовали, если чистота была> 95% и их экспрессия CD14 и CD83 была <10%.Экспрессию антигенов HSV-2 в DC, подвергнутых воздействию HSV-2, осуществляли с помощью поликлональных антител против HSV-2 (B0116, Dako, Дания). Влияние инфекции на различные белки оценивали путем окрашивания конъюгированным с PE-Cy7 антителом против APOBEC3G человека (Abcore, США), конъюгированным с Alexa Fluor 647 антителом против SAMHD1 человека (Bioss Inc., США), конъюгированным с Alexa Fluor 647 анти- человеческий TREX1, антитела против IRF3 человека, конъюгированные с PE антитела против NAK / TBK1 человека, антитела против человеческого IFI16 (Abcam, Великобритания), против CF150 человека (cGAS) (Thermofisher Scientific) и конъюгированные с PE антитела против STING человека ( BD Europe).Неконъюгированные антитела окрашивали конъюгированными вторичными антикроличьими антителами (DAKO). Окрашенные образцы DC оценивали с помощью проточной цитометрии (FACS Canto II, BD) и анализировали с помощью FlowJo (Treestar, Ashland, OR, США).

Лиганды и ингибиторы

В экспериментах использовались следующие лиганды и ингибиторы TLR: лиганд TLR2 PAM (5 мкг / мл), лиганд TLR3 Poly I: C (40 мкг / мл), 2’3′-cGAMP, (10 мкг / мл), Поли dA: dT (0,5 мкг / мл), голая ДНК HSV-60 (10 мкг / мл), олигонуклеотид A151 ODN TTAGGG (1–3 мкМ) (Invivogen, Франция), рекомбинантный белок pp65 (UL83) человека (10–15 мкг / мл) (Miltenyi Biotec, Швеция), рекомбинантный белок E7 вируса папилломы человека 18 типа (10–20 мкг / мл) (SMS-gruppen, Дания) и ацикловир (20–50 мкМ) (SIGMA).Ацикловир добавляли за 1 час до добавления вируса, инкубировали с вирусом в течение 2 часов, смывали, пополняли и после этого оставляли в культуре на протяжении всей инкубации. Внутриклеточная доставка cGAMP, Poly dA: dT, голой ДНК HSV-60, олигонуклеотида A151, белка UL83 и белка E7 была достигнута с использованием коммерческой системы DOTAP (SIGMA). Вкратце, различные лиганды и ингибиторы смешивали с забуференным HEPES физиологическим раствором и DOTAP в течение 30 минут при комнатной температуре, инкубировали в течение 2 часов при 37 ° C с DC и промывали перед заражением.Только ДОТАП служил контролем за действием системы доставки.

RNAseq

(5 нг) подвергали амплификации с полным транскриптомом с использованием набора NuGEN Ovation RNA-Seq V2 (Сан-Карлос, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, кДНК амплифицировали из общей РНК с использованием изотермической амплификации с одним праймером (SPIA). Затем амплифицированные образцы кДНК очищали с использованием набора MinElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen; Валенсия, Калифорния, США). Образцы кДНК были фрагментированы на более мелкие кусочки, с тупыми концами, лигированы с индексированными (штрих-кодированными) адаптерами и амплифицированы с использованием набора Ultralow System V2 в соответствии с протоколом производителя.Окончательное распределение размеров библиотек определяли с использованием Agilent Bioanalyzer 2100. Пять библиотек от пяти разных доноров секвенировали на платформе Illumina NextSeq500 (Сан-Диего, Калифорния, США). Файлы FASTQ были загружены в UPPMAX, а качество проверено с помощью fastQC (39). Trimmomatic (40) использовался для удаления адаптеров и низкокачественных оснований, а считанные данные затем были сопоставлены с эталонным геномом человека hg19 с помощью STAR (41). Количество для каждого гена было рассчитано с помощью featureCounts (42). Данные были нормализованы и дифференциально экспрессируемые гены определены с использованием R / DeSeq2 (43).Анализ путей проводился с помощью анализа пути изобретательности (Qiagen), анализа R, анализа обогащения онтологией генов (GO) (Geneontology.org) и пользовательских списков генов.

Статистический анализ

GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) использовали для анализа всех данных, кроме RNAseq. Для проверки статистической значимости использовались повторные измерения ANOVA с последующим пост-тестом Бонферрони или двусторонний парный тест t . Результаты считались статистически значимыми, если p <0.05. Все эксперименты проводились минимум четыре раза с использованием клеток, полученных от разных доноров крови. Когда экспериментальные значения были нормализованы, среднее значение свободного вируса или ложного вируса было установлено на 1. Результаты qPCR были нормализованы для различий между планшетами, как описано ранее (38). Вкратце, каждое значение было вычтено из среднего значения всех значений, а затем полученные значения были разделены на среднее значение ложного или свободного вируса в зависимости от различных экспериментов.

Результаты

Кондиционирование ВПГ-2 DC человека сделало их более восприимчивыми к ВИЧ-инфекции

Теперь очевидно, что инфекция половых путей, вызванная ВПГ-2, предрасполагает к ВИЧ-инфекции и усилению выделения вируса на слизистую оболочку (2, 3, 5-7).Тем не менее механизмы, лежащие в основе повышенной инфекции, остаются неоднозначными. Здесь мы оценили роль ДК в усилении инфекции, оценивая эффекты до воздействия ВПГ-2 на ВИЧ-инфекцию человеческих ДК, происходящих из моноцитов, и роль опсонизации вирусов комплементом. Уровни транскриптов мРНК gag ВИЧ были значительно увеличены в ДК, подвергнутых двойному воздействию ВПГ / ВИЧ, по сравнению с уровнями, индуцированными только ВИЧ, как через 6, так и через 24 часа (рис. 1А). Связанное с HSV-2 усиление ВИЧ-инфекции согласуется с выводами Marsden et al.(8). Более того, ДК, подвергшиеся воздействию опсонизированного комплементом ВПГ-2, давали более высокий уровень тирозин-кинез (ТК) как в двойном, так и в однократном воздействии ДК по сравнению со свободным вирусом, как показано ранее, но не было изменений в инфекции ВПГ-2 при измерении экспрессии ТК. в DC, подвергнутых двойному воздействию ВИЧ / HSV, по сравнению с DC, подвергнутым однократному воздействию HSV-2 (дополнительный рисунок 1). Продуктивная ВИЧ-инфекция также была значительно повышена в клетках, подвергнутых двойному воздействию ВПГ / ВИЧ, что измерено процентным содержанием GFP-ВИЧ-положительных ДК с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии на 3-й и 5-й день после контакта (рис. 1B), а также уровнями p24 ВИЧ в супернатанты культуры на 4-й и 1-9-й дни (рис. 1C).Опсонизация вирионов существенно не изменила уровень ВИЧ-инфекции в инфицированных HSV / ВИЧ клетках (рисунки 1A – C). Следует отметить, что присутствие HSV-2 усиливало ВИЧ-инфекцию, как когда DC были предварительно кондиционированы HSV-2 перед ВИЧ-инфекцией, так и когда HSV-2 и ВИЧ были введены в DC одновременно. В нормальных условиях только небольшая часть DC будет продуктивно инфицирована ВИЧ (рис. 1B), то же самое относится и к HSV-2 (18). Тем не менее, все ДК в культурах подвергаются воздействию вирусов и подвергаются их влиянию либо косвенно, либо напрямую, даже в отсутствие продуктивной инфекции (18, 36).Количество ДК, которые поддерживают продуктивную инфекцию как ВИЧ, так и ВПГ-2, невелико и было показано Marsden et al. чтобы представить только 1% ячеек. В нашей системе мы определили, что уровень DC с продуктивной ВИЧ-инфекцией и положительным по антигену HSV-2 должен составлять 5% для DC свободного ВИЧ / HSV и ~ 12% для DC, подвергнутого воздействию опсонизированного комплементом CHIV / CHSV (рис. 1D), что может отражать то, что не все антиген-положительные клетки HSV-2 продуктивно инфицированы, скорее, что некоторые клетки имеют абортивную инфекцию HSV (44–46).Данные для прямой и отсроченной коинфекции дали очень похожие данные, поэтому эксперименты, представленные и проведенные далее, основаны на установке отсроченной коинфекции. Взятые вместе, наши данные ясно демонстрируют, что воздействие ВПГ-2 увеличивает способность ВИЧ продуктивно инфицировать ДК, что побудило нас выяснить основной механизм, ответственный за усиление ВИЧ-инфекции.

Рисунок 1 . ВПГ-2 кондиционирование дендритных клеток человека сделало их более восприимчивыми к ВИЧ-продуктивной ВИЧ-инфекции.Дендритные клетки подвергали воздействию свободного HSV-2 (HSV) или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов, затем промывали и инфицировали свободным ВИЧ, либо ВИЧ-1 BaL, либо GFP, меченный CCR5, тропический ВИЧ-1 (GFP-HIV) или комплемент. опсонизированный ВИЧ (CHIV) в течение 6 или 22 часов. Положительные по HSV-2 DC измеряли с использованием поликлональных антител к HSV-2 с последующим определением конъюгированных с флуорохромом вторичных Ab (A). Уровни экспрессии мРНК HIV gag определяли с помощью кПЦР через 6 и 24 часа. Данные нормализуются для бесплатного вируса, который устанавливается как один. (B) GFP-ВИЧ-положительные клетки оценивали с помощью проточной цитометрии через 3 и 5 дней после инфицирования ВИЧ или с помощью конфокальной микроскопии (40 ×) через 5 дней после заражения. GFP-HIV продуктивно инфицированные клетки (зеленые), окрашенные ядерным окрашиванием DAPI (синий). Размерная полоса = 20 мкм. (C) Высвобождение p24 ВИЧ-1 продуктивно инфицированными DC определяли с помощью ELISA с 1 по 9 день после инфицирования ВИЧ. (D) Процент ВИЧ-GFP-положительных и антиген-положительных ВПГ-2 DC, измеренный с помощью проточной цитометрии через 24 часа после инфицирования.* p <0,05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Отчетливое клеточное программирование было индуцировано в DC различными условиями инфицирования ВИЧ и HSV-2

Чтобы лучше понять клеточное программирование во время инфекции HSV / HIV, мы выполнили seq РНК, которая предоставила полный профиль транскриптома в DC, индуцированных однократным воздействием ВИЧ по сравнению с двойным воздействием HSV-2 и ВИЧ. Анализ транскриптома продемонстрировал активацию и участие различных наборов путей в одиночных и двойных инфицированных DC соответственно.ДК, подвергнутые двойному воздействию вируса, активировали или подавляли значительно больше генов, чем ДК, подвергавшиеся только ВИЧ и CHIV (рис. 2А). Это продемонстрировало, что воздействие как ВПГ, так и ВИЧ было более сильным активатором ДК, чем только ВИЧ, и что опсонизация комплемента вирионов подавляла активацию ДК. Затем наш анализ обогащения генов четко установил, что каждое из различных вирусных состояний привело к возникновению уникальных паттернов экспрессии генов в различных сигнальных путях (рисунки 2B, C; дополнительный рисунок 2).В условиях CHIV и CHIV / CHSV были менее обогащенные пути по сравнению с группами свободных вирусов (Фигуры 2B, C). Гены в путях передачи сигналов интерлейкина и JAK / STAT были обогащены как ДК, подвергнутым двойному воздействию, так и ВИЧ, CHIV и ВИЧ / ВПГ, но только ВИЧ / ВПГ имели значительное обогащение (дополнительный рисунок 2). Недавно было показано, что путь убиквитин-протеасома играет важную роль в вирусном патогенезе (47). Гены, участвующие в этом пути, были значительно обогащены свободными контактами ВИЧ и ВИЧ / ВПГ, но только ограниченное количество генов было обогащено в группах, подвергшихся воздействию комплемента (дополнительный рисунок 2).Обогащенный анализ генов со сниженным уровнем экспрессии после ВИЧ-инфекции показал, что гены пути биосинтеза холестерина были значительно обогащены ДК, подвергнутыми воздействию CHIV, а гены, участвующие в метаболизме пиримидина, были обогащены как ДК, подверженными воздействию ВИЧ / ВПГ, так и CHIV / CHSV (дополнительные Фигура 2). Более конкретный, углубленный анализ обогащения генов с акцентом на воспаление, противовирусные и иммунные реакции выявил паттерн значительно обогащенных путей, отчетливо различающихся для каждого типа инфекционного состояния, хотя в группах наблюдалось некоторое совпадение (Рисунки 2B, C; Дополнительный рисунок 2).Например, активированные гены в каскаде JAK-STAT были значительно обогащены для всех групп, кроме CHIV (дополнительный рисунок 2).

Рисунок 2 . Клеточное программирование дендритных клеток при одиночной инфекции ВИЧ и двойной инфекции ВИЧ / ВПГ. Дендритные клетки подвергали воздействию HSV-2 (HSV) или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов, затем инфицировали ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 24 часов. Было выполнено полное секвенирование транскриптома. (A) Анализ количества значительно активированных или подавляемых генов с оценкой общих, двух-, четырех- и восьмикратных изменений по сравнению с ложным (B) Анализ обогащения генов для генов, значительно активированных в три или более раз с помощью р ≥ 0.05 с акцентом на воспалительные и противовирусные пути / факторы. (C) Анализ обогащения генов значительно активизировал в три или более раза с p ≥ 0,05. Анализ обогащения GO был выполнен с набором данных PANTHER pathways. Термины со статистической значимостью в любом списке генов показаны в виде столбчатой ​​диаграммы с накоплением. * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005. Ось Y = количество перечисленных генов, участвующих в указанном пути PANTHER.Ссылка = ожидаемый номер гена из ссылки (полные гены человека в базе данных). N = 5.

Воспалительные факторы были значительно повышены в ДК, подвергнутых двойному воздействию ВПГ-2 и ВИЧ

ВИЧ и ВПГ-2 индуцируют воспалительные пути в иммунных клетках, причем ВПГ-2 является более мощным активатором (18, 20), и наш анализ транскриптома четко продемонстрировал активацию и участие нескольких воспалительных путей. HSV / HIV или CHSV / CHIV индуцировали различные паттерны экспрессии генов в DC для воспалительных генов по сравнению с одной инфекцией HIV или CHIV (рис. 3A).Более того, опсонизированные комплементом группы имели более низкие уровни транскрипции многих воспалительных факторов (рис. 3А). Один только ВИЧ, HSV / HIV и CHSV / CHIV активировали множественные воспалительные факторы, такие как IL-6, TNF, CXCL1 и CCL20, причем самая высокая экспрессия активировалась в группах с коинфекцией. Опсонизация комплемента снижает транскрипцию нескольких факторов, таких как CCL1, CCL5, CCL8 и IL-1β, видя, что они были ниже в опсонизированных группах по сравнению с условиями без вируса. CCL21, CCL28 и IL34 были активированы только в группах, подвергнутых двойному воздействию.Некоторые гены имели более высокие уровни экспрессии в группе CHIV и включали CXCR3 и IL-10. Затем мы проверили характер экспрессии некоторых воспалительных факторов с помощью кПЦР и трансляции с помощью ELISA или набора гранул цитокинов на основе потока. Сам по себе HSV был ведущим индуктором TNF и CCL3, тогда как ВИЧ-1 был более мощным в отношении индукции CXCL8 и IL-1β (дополнительная фигура 3). HSV / HIV и CHSV / CHIV вызывают более высокие уровни экспрессии мРНК TNF, CXCL8 и CCL3 по сравнению со свободным и опсонизированным комплементом ВИЧ (рис. 3B).Уровни мРНК IL-1β были сходными между DC и ВИЧ / ВИЧ / HSV (рис. 3B), тогда как уровни белка были выше в DC, подвергнутых двойному воздействию (рис. 3C). Секреция TNF и хемокинов CCL3 и CCL5 следовала паттерну экспрессии мРНК и / или данным транскриптома (Фигуры 3A – C; данные не показаны). Уровни белка других воспалительных факторов, таких как CXCL10, были ниже в DC, подвергшихся воздействию обоих вирусов, по сравнению с одним только ВИЧ (рис. 3C). Эти несоответствия между уровнями белка и данными транскриптома могут быть объяснены посттранскрипционной регуляцией и / или протеолитической деградацией (48-50).Транскрипция воспалительных факторов активируется несколькими сигнальными путями, включая путь MAPK p38, и двойное воздействие значительно повышает уровень фосфорилированного p38 с тенденцией к тому, что опсонизация вирионов снижает фосфорилирование p38 (Рисунок 3D). Фосфорилирование JNK показало тот же паттерн активации, что и MAPK p38, но не было значительных различий (данные не показаны), что могло быть связано с моментом времени, выбранным для измерения.

Рисунок 3 .Воспалительные пути были сильно активированы в DC, подвергнутых воздействию HSV / HIV, на транскрипцию мРНК. (A) Дендритные клетки подвергали воздействию свободного HSV-2 или опсонизированного комплементом вируса (CHSV-2) в течение 2 часов, затем инфицировали ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 22 часов. Тепловая карта по воспалительным факторам, значительно повышенная или пониженная в одной или нескольких группах DC HIV, CHIV, HSV-2 / HIV или CHSV-2 / CHIV, по сравнению с ложно обработанными DC из экспрессии мРНК seq (B) РНК уровни IL-1β, TNF, CCL3, CXCL8 определяли с помощью ПЦР.Данные были нормализованы для фиктивного набора 1. (C) Уровни секретируемых цитокинов оценивали с помощью ELISA для TNF и набора гранул цитокинов для IL-1β, CCL5 и CXCL10. (D) Уровень фосфорилирования MAPK p38 оценивали в лизатах DC, подвергнутых воздействию HSV-2 или CHSV-2 в течение 2 часов с последующим воздействием ВИЧ или CHIV в течение 4 часов с помощью набора фосфопротеиновых шариков. * p <0,05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Воздействие ВИЧ / ВПГ вызывало более высокую экспрессию нескольких противовирусных факторов, включая IFN-β, в DC по сравнению с воздействием только ВИЧ

Анализ транскриптома (рис. 2) четко продемонстрировал активацию и участие множества противовирусных путей в ДК, подверженных как только ВИЧ, так и HSV и ВИЧ.Здесь мы оценили факторы, участвующие в активации и регуляции клеточной противовирусной защиты (рис. 4А). Паттерн для многих противовирусных факторов, индуцированных в DC, был аналогичен между ВИЧ и условиями двойных вирусных DC и в целом более низким уровнем антивирусных факторов, активированных в группах комплемента. Несколько генов TRIM, гены IFN типа I, гены SOCS и гены IRF были активированы в свободном ВИЧ и в двойно экспонированных DC, причем самые высокие уровни транскрипции в основном обнаруживались в двойных DC.Многие антивирусные гены были активированы в DC, подвергнутых воздействию HIV / HSV и CHIV / CHSV, тогда как было обнаружено, что несколько антивирусных генов активированы только в DC, подверженных воздействию ВИЧ, и включают IFITM3, SOCS5 и TBK1 для свободного ВИЧ и IFITM3 для CHIV (рис. 4A). Затем мы подтвердили некоторые из этих противовирусных факторов на уровне мРНК и белка. Однократное воздействие ВПГ и двойное воздействие ВПГ / ВИЧ увеличивало уровни экспрессии мРНК IFN-β и MX1 по сравнению с однократным воздействием ВИЧ (рисунки 4A, B; дополнительный рисунок 4), ясно показывая, что HSV является компонентом, ответственным за сильную противовирусную активность. ответы.Кроме того, секреция IFN-β была выше в образцах, подвергнутых двойному воздействию, причем самые высокие уровни были вызваны HSV / HIV (рис. 4C). Интересно, что уровни IFN-β не коррелировали отрицательно с уровнями ВИЧ-инфекции, что позволяет предположить, что IFN-β оказывал ограниченное влияние на инфекцию даже при высоких уровнях IFN-β, наблюдаемых в ДК, подвергнутых двойному воздействию. Петля обратной связи IFN-β индуцирует активацию STAT1 и транскрипцию IFN-регулируемых генов (ISG). Наши данные ясно показали, что воздействие DC на ВИЧ вызывало значительно более высокое фосфорилирование STAT1 через 6 часов по сравнению с CHIV, HSV / HIV и CHSV / CHIV (рис. 4D).Кроме того, ВИЧ и ВПГ / ВИЧ также значительно активировали несколько ISG, включая IFITM1, RSAD2 и ISG15 (рис. 4A).

Рисунок 4 . В дендритных клетках, подвергшихся воздействию ВПГ / ВИЧ, были высокоактивны противовирусные факторы и пути. Дендритные клетки подвергали воздействию HSV-2 или опсонизированного комплементом вируса (CHSV-2) в течение 2 часов с последующей инфекцией ВИЧ или опсонизированного комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 22 часов. (A) Тепловая карта на основе данных последовательности РНК антивирусных факторов, значительно повышенных или пониженных в одном или нескольких из инфекционных состояний ВИЧ, CHIV, HSV-2 / HIV или CHSV-2 / CHIV по сравнению с ложно обработанными DC ( B) уровней экспрессии мРНК IFN-β и MXA определяли с помощью ПЦР.Данные были нормализованы к ложному набору 1. (C) Уровни секретируемого IFN-β оценивали с помощью ELISA. (D) Уровень фосфорилирования STAT1 оценивали в лизатах из DC, подвергнутых воздействию HSV-2 или CHSV-2 в течение 2 часов с последующим воздействием ВИЧ или CHIV в течение 4 часов с помощью набора фосфопротеиновых шариков. * p <0,05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Требуется интактная структура ДНК HSV-2 для усиления ВИЧ-инфекции в DC

Чтобы оценить, было ли усиление ВИЧ-инфекции в ДК следствием продуктивной инфекции HSV-2 с репликацией полноразмерной ДНК или этого было достаточно с доставкой интактной доступной дцДНК с помощью вирионов, мы использовали ацикловир и γ-облученный инактивированный HSV- 2 (51).В отсутствие репликации ДНК ВПГ-2 γ-облученный инактивированный ВПГ-2 не смог повысить уровень ВИЧ-инфекции и уровни экспрессии TNF и IFN-β (фиг. 5A), что ясно указывает на то, что увеличение инфицирования ВИЧ DC зависит от наличия доступной и / или интактной ДНК HSV-2. Инактивация HSV-2 γ-облучением вызывает повреждение ДНК, которое может сделать вирусную ДНК менее реактивной с внутриклеточными PRR, влиять на транспорт ДНК к ядру и / или влиять на высвобождение ДНК из вирусного капсида.Мы использовали ингибитор репликации HSV-2 ацикловир, чтобы проверить, было ли присутствие интактной ДНК HSV-2 в DC достаточным для усиления ВИЧ-инфекции или требуется ли активная репликация ДНК HSV-2. Ингибирование активной репликации ДНК HSV-2 в DC мало влияло на ВИЧ-инфекцию и IFN-β, но снижало ответ IFN-β, однако эти результаты не были статистически значимыми (фиг. 5B). Чтобы дополнительно установить роль дцДНК, мы доставили HSV60, последовательность дцДНК размером 60 п.н. из HSV-1, используя DOTAP, в DC.Внутриклеточная дцДНК значительно усиливала инфекцию FHIV и CHIV по сравнению с одним только ВИЧ (рис. 5C). Взятые вместе, усиление ВИЧ-инфекции и повышенная продукция IFN-β в двойно экспонированных DC требовали присутствия дцДНК HSV-2 в ее естественной конфигурации, что предполагает, что активация внутриклеточных PRR, таких как сенсоры ДНК, может лежать в основе усиления HSV-2. ВИЧ-инфекции ДК.

Рисунок 5 . Интактная дцДНК ВПГ необходима для усиления ВИЧ-инфекции в ДК. (A) Дендритные клетки подвергали воздействию инфекционного или гамма-облученного HSV-2 (γ-HSV-2) или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов, затем промывали и инфицировали ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 22 часов. . Уровни экспрессии мРНК транскрипта gag ВИЧ-1, TNF и IFN-β определяли с помощью ПЦР. (B) ДК предварительно обрабатывали ацикловиром (20–50 мкМ) в течение 1 часа, а затем подвергали воздействию HSV или CHSV в течение 2 часов, затем промывали и инфицировали ВИЧ или CHIV в течение 22 часов с добавлением ацикловира в культуру.Уровни экспрессии генов транскрипта gag ВИЧ-1, TNF и IFN-β определяли с помощью ПЦР. (C) DC обрабатывали HSV60, доставляемым DOTAP, или без него, а затем подвергали воздействию HSV или CHSV в течение 2 часов, затем промывали и инфицировали ВИЧ или CHIV в течение 22 часов с добавлением ацикловира в культуру. Уровни экспрессии генов транскрипта gag ВИЧ-1, TNF и IFN-β определяли с помощью ПЦР. Данные были нормализованы для ВИЧ, установленного как 1 для транскрипта gag ВИЧ-1, и ложного набора как 1 для TNF и IFN-β. * р <0.05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Внутриклеточные PAMP, производные от HSV, являются основными факторами, участвующими в усилении инфицирования DC ВИЧ

Чтобы оценить роль различных PAMP в усилении ВИЧ-инфекции, вызванной HSV-2, в DC, мы исследовали, может ли активация TLR2, TLR3 или cGAS / STING имитировать эффекты, наблюдаемые после инфицирования HSV-2. Известно, что как TLR2, так и TLR3 вовлечены в инфекцию HSV-2 (52, 53). Стимуляция TLR2 одновременно с ВИЧ-инфекцией не влияла на экспрессию gag ВИЧ по сравнению с одним ВИЧ (рис. 6А).Нацеливание на TLR3 дало лишь немного увеличенную экспрессию gag ВИЧ по сравнению с резко увеличенной экспрессией gag ВИЧ в DC, подвергнутых воздействию как HSV-2, так и ВИЧ (фиг. 6A). Хотя воспалительные реакции только на агонист TLR3 и агонист TLR3 в комбинации с ВИЧ были выше, чем воспалительные ответы только на ВИЧ, ни TNF, ни IL1-β не приблизились к уровням, наблюдаемым при двойном воздействии с HSV-2 (фиг. 6A; данные не показаны). Увидев, что TLR2 указан как важный фактор в активации клеток, индуцированной HSV-2 (52, 54), мы исследовали эффекты ингибирования пути TRL2 антагонистическим лигандом TLR2 на ВИЧ-инфекцию.Наши результаты исключают участие передачи сигналов TLR2 в усилении ВИЧ-инфекции (дополнительный рисунок 5). Принимая во внимание, что несколько межклеточных сенсоров, участвующих в инфекции HSV, например IFI16 и cGAS, которые объединяют свои сигнальные пути путем активации STING (28, 48, 55), мы исследовали влияние активации STING на ВИЧ-инфекцию. Исследовали уровни ВИЧ-инфекции в ДК после экзогенной и эндогенной стимуляции cGAMP, активатором STING через cGAS. Экзогенно доставленный цГАМФ оказывал незначительное влияние на уровень ВИЧ-инфекции, в то время как эндогенно доставленный цГАМФ, т.е.е., доставленный в цитозоль через DOTAP, значительно усилил ВИЧ-инфекцию до уровней, аналогичных DC, подвергающимся воздействию ВИЧ / HSV (фиг. 6B). Это указывает на то, что внутриклеточная ДНК, воспринимающая путь cGAS / STING, является одним из путей, участвующих в опосредованном HSV-2 усилении ВИЧ-инфекции в DC. ВИЧ-инфекция в сочетании с эндогенным цГАМФ, т. Е. ЦГАМФ, доставленным в цитозоль, индуцировала более высокие уровни экспрессии IFN-β в ДК по сравнению с одним ВИЧ и ВИЧ в сочетании с экзогенно доставленным цГАМФ (фиг.6В).Более высокие уровни IFN-β, экспрессируемые ДК, подвергнутыми воздействию HSV / ВИЧ, по сравнению с уровнями, индуцированными ВИЧ в комбинации с эндогенным цГАМФ, указывают на то, что другие сигнальные пути / факторы могут участвовать в противовирусном ответе в дополнение к пути цГАМФ / STING. Примечательно, что высокие уровни IFN-β, вызванные двойным воздействием, не препятствовали инфицированию ВИЧ в DC, поскольку воздействие цГАМФ и ВИЧ / HSV индуцировало высокие уровни gag ВИЧ (рис. 6B).

Рисунок 6 . Нуклеотиды, происходящие из внутриклеточного HSV-2, являются основными факторами, участвующими в усилении ВИЧ-инфекции в DC. (A) Незрелые DC подвергались действию TLR2 или агонистов TLR3 по отдельности или в комбинации с ВИЧ в течение 16 часов или подвергались воздействию HSV-2 (HSV) в течение 2 часов с последующим воздействием ВИЧ в течение 16 часов. Транскрипт gag ВИЧ, экспрессию IL1-β, TNF и IFN-β оценивали с помощью qPCR. (B) cGAMP вводили напрямую или через DOTAP в DC отдельно или вместе с ВИЧ в течение 16 часов, или DC подвергали воздействию HSV в течение 2 часов с последующим контактом с ВИЧ в течение 16 часов. Транскрипт gag ВИЧ, экспрессию IL1-β, TNF и IFN-β оценивали с помощью ПЦР.Данные транскрипта gag ВИЧ были нормализованы для набора ВИЧ как 1, а данные TNF, IL1-β, IFN-β были нормализованы для фиктивного набора как 1. * p <0,05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Двойное воздействие ДК на ВПГ / ВИЧ, активировавшее и впоследствии снижающее уровни белков цитозольных ДНК-сенсоров и факторов, участвующих в их сигнальных путях

Оценивали влияние HSV-2 на межклеточные сенсоры в DC. Анализ транскриптома показал, что экспрессия цитозольной ДНК и РНК-сенсоров AIM2, MB21D1 (cGAS), IFIh2, DDX58 (RIG1) и ZBP1 (DAI) была сильно повышена, а IFI16 была немного увеличена в ДК, подвергнутых воздействию только ВИЧ, и в двойные открытые DC.Экспрессия MAVS, DDX41 и DHX9 снижалась или не зависела от различных состояний ВИЧ и ВПГ / ВИЧ (фигура 7A). Некоторые вирусы, включая вирусы герпеса, обладают способностью регулировать факторы врожденных и адаптивных реакций клетки путем вмешательства в передачу сигнала или деградацию белков. Например, HSV1 ICP27 подавляет экспрессию IFN типа I в макрофагах человека за счет взаимодействия с STING / TBK1 (56). Литическая реактивация вируса герпеса, связанного с саркомой Капоши, вызывает деградацию IFI16 (25), а STING разрушается протеазой вируса денге (57).Более того, стимуляция врожденных сигнальных путей, например, STING, TBK1 и IRF3, может приводить к подавлению белка после активации антивирусных реакций после патогенов (58–60). В свете этого мы оценили уровни белка нескольких сенсоров ДНК и сигнальных молекул в ДК, подвергнутых воздействию ВИЧ, ВПГ или ВИЧ / ВПГ, соответственно, и обнаружили, что воздействие одного ВПГ и двойного вируса значительно снижает экспрессию сенсоров ДНК. , и cGAS, оба активатора пути STING, ясно указывая на то, что это, прежде всего, эффект, производный от HSV (рис. 7B).Не было значительных различий в эффектах, наблюдаемых с опсонизацией или без нее. Итак, затем мы исследовали экспрессию белков факторов в пути STING и не обнаружили значительного влияния на белок STING, даже если была четкая тенденция к снижению уровня белка STING для ВИЧ / HSV, но нижестоящий фактор TBK1 от STING был значительно снижен и наблюдалась тенденция к снижению экспрессии IRF3 в DC, подвергнутых двойному воздействию, по сравнению с одним только ВИЧ (фигура 7C). Взятые вместе, эти результаты показывают, что протеолитическая деградация этих белков индуцируется в первую очередь HSV и может происходить в DC, подвергнутых воздействию HSV-2, либо как прямые эффекты вирусных белков и / или из-за вирусной активации путей с участием этих факторов, что впоследствии приводит к к их деградации (58).

Рисунок 7 . ВПГ-2 ВИЧ-инфекция ДК индуцировала активацию и деградацию сенсоров цитозольной ДНК. Дендритные клетки подвергали воздействию свободного HSV-2 (HSV) или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов, затем инфицировали ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 22 часов. (A) Тепловая карта по антивирусным факторам значительно повышается или понижается в одной или нескольких группах DC HIV, CHIV, HSV / HIV или CHSV / CHIV по сравнению с DC, обработанными ложно, с помощью последовательности RNA seq. (B) Уровни IFI16 и cGAS в DC в различных условиях инфицирования путем окрашивания клеток и анализа с помощью проточной цитометрии. (C) Уровни STING, TBK1 и IRF3 в DC в различных условиях инфицирования путем окрашивания клеток и анализа с помощью проточной цитометрии. *** р <0,0005. N = 5–8.

Активация пути STING была необходима для усиленной ВИЧ-инфекции DC, индуцированной HSV-2

Путь STING активируется вышестоящими датчиками ДНК, такими как cGAS и IFI16, оба реализуются в цитозольном распознавании ДНК ВПГ (27, 61). Кроме того, недавние данные указывают на сотрудничество между IFI16 и cGAS в активации STING (62), при этом IFI16 и cGAS играют разные роли в противовирусных ответах против герпесвирусов (63).Примечательно, что другие исследования утверждают, что cGAS является основным сенсором дцДНК, ответственным за активацию пути STING / TBK / IRF3 (29, 64). Здесь мы оценили роль cGAS / IFI16 в усилении ВИЧ-инфекции в ДК, кондиционированных HSV-2, с использованием ингибирующего олигодезоксинуклеотида A151 (65). Первоначально предполагалось, что внутриклеточный A151 ингибирует IFI16, но недавние открытия показали, что он также влияет на активность cGAS (65, 66). Ингибирующий олигодезоксинуклеотид A151 немного увеличивал ВИЧ-инфекцию, оцениваемую по транскрипту gag, в ранний момент времени (8 ч) в DC, подвергнутых воздействию ВИЧ и HSV / ВИЧ.Через 24 часа не было различий между обработанными A151 и необработанными DC двойным воздействием (фигура 8A). Интересно, что ингибирующий олигодезоксинуклеотид A151 снижал экспрессию мРНК IFN-β в условиях HSV / HIV как через 8, так и через 24 часа (фиг. 8A). Чтобы подтвердить результат цитозольного A151, мы также протестировали эффект цитозольной доставки белка герпеса UL83, который обладает способностью вмешиваться в функции IFI16 (67) и cGAS (68), в DC, подвергнутых воздействию ВИЧ или HSV / ВИЧ. UL83 показал тот же профиль, что и A151, в отношении экспрессии транскриптов мРНК gag и IFN-β (фигура 8; дополнительная фигура 6).Данные показали, что ингибирование cGAS / IFI16 ингибирующим олигодезоксинуклеотидом A151 или UL83 было недостаточно для подавления усиленной ВИЧ-инфекции, но позволило снизить, но не полностью подавить ответ IFN-β, поэтому мы не могли исключить остаточную активность. этих путей в DC. Для дальнейшего изучения роли пути STING в усилении инфекции и повышенном противовирусном ответе в двойных экспонированных DC, мы нацелены на белок STING, используя рекомбинантный белок HPV 18 E7, который, как известно, ингибирует этот путь путем связывания и блокирования STING (69, 70).Внутриклеточно доставленному E7 удалось снизить экспрессию транскрипта gag и IFN-β в двойных инфицированных DC. Снижение, однако, было незначительным для кляпа, но можно было увидеть тенденцию (Рисунок 8B). Затем, чтобы проверить и усилить роль STING, мы оценили роль пути STING с использованием линии клеток THP1, лишенной укуса из-за нокаута STING с помощью siRNA, и обнаружили снижение экспрессии gag в клетках, подвергшихся воздействию ВИЧ / HSV, но не получили четких доказательств этого в CHSV / CHIV (рис. 8C), что может быть связано с низким уровнем CR3 в THP1.Взятые вместе, наши результаты показывают, что путь STING участвует в усилении ВИЧ-инфекции в DC, подвергнутых воздействию HSV-2.

Рисунок 8 . Путь STING был вовлечен в усиление ВИЧ-инфекции ДК, подвергшихся воздействию ВПГ-2. Ингибитор IFI16 / cGAS олигонуклеотид A151 доставлялся внутриклеточно с помощью DOTAP к DC. Затем клетки подвергали воздействию свободного HSV-2 (HSV) или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов перед инфицированием ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение (A) 6 часов (B) или 22 часов. (B) Ингибитор белка STING Белки E7 HPV 18 доставлялись внутриклеточно с помощью DOTAP к DC. Затем клетки подвергали воздействию свободного HSV или CHSV в течение 2 часов перед инфицированием ВИЧ или CHIV в течение 22 часов. Транскрипт gag ВИЧ и экспрессия IFN-β оценивали с помощью qPCR. (C) THP1 клетки с нокаутом по STING или дикого типа подвергали воздействию свободного HSV-2 или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов, затем инфицировали ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 22 часов. Транскрипт gag ВИЧ и экспрессия IFN-β оценивали с помощью qPCR.Данные по gag для ВИЧ были нормализованы для свободного вируса, установленного как 1, и данные IFN-β были нормализованы для фиктивного набора как 1. * p <0,05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Усиление инфицирования ВИЧ у DC, инфицированных HSV-2, вероятно, было связано со снижением уровней регуляторных факторов ВИЧ как следствие активации пути cGAS-STING

Профили транскриптома ясно продемонстрировали комбинаторные эффекты воздействия HSV-2 и ВИЧ на многие главные регуляторы ВИЧ-инфекции в DC, включая SAMHD1, TREX, APOBEC3G, PPIA (циклофилин A) и BST2 (тезерин) (рис. 9A).Экспрессия генов большинства регуляторных факторов ВИЧ была увеличена в DC, инфицированных только ВИЧ или в сочетании с HSV-2, по сравнению с контролем, тогда как экспрессия SAMHD1 была снижена. Кроме того, BST2 был немного снижен в группе CHIV / CHSV. Инфекция HSV-2 может модулировать экспрессию нескольких белков (25, 71), а активация противовирусных и врожденных путей может влиять на экспрессию и уровни белка, поэтому мы исследовали влияние воздействия HSV-2 на уровни белков регуляторов ВИЧ. в РЦ.Уровни белка SAMHD1, APOBEC3G и TREX1 были значительно ниже в одинарных HSV и CHSV и в двойных DC, подвергнутых воздействию HSV / HIV и CHIV / CHSV, по сравнению с ложно обработанными клетками. ВИЧ и CHIV не оказали влияния на эти факторы или оказали минимальное влияние на эти факторы (рис. 9B). Затем мы оценили, зависит ли снижение регуляторных факторов ВИЧ от внутриклеточной активации пути cGAS-STING дцДНК, полученной из HSV-2, с помощью цГАМФ, который продуцируется после активации дцДНК cGAS (61, 72). ДК, подвергавшиеся как цитозольному cGAMP, так и ВИЧ, имели более низкие уровни белка как SAMHD1, так и TREX1 по сравнению с ДК, подвергавшимися только воздействию ВИЧ (рис. 9С).В случае APOBEC3G на экспрессию цГАМФ не влиял, что свидетельствует о более сложной активации и / или протеолизе, индуцированных факторами, производными от HSV-2, по сравнению с одним цГАМФ (фиг. 9С). Эти данные демонстрируют, что путь cGAS-STING, активируемый интактной ДНК HSV-2, способствует усилению ВИЧ-инфекции в DC, опосредованному HSV-2, за счет уменьшения количества нескольких ключевых регуляторных факторов ВИЧ.

Рисунок 9 . Активация пути STING в двойных инфицированных DC снижает уровни белков нескольких факторов рестрикции ВИЧ.Дендритные клетки подвергали воздействию свободного HSV-2 или опсонизированного комплементом вируса (CHSV) в течение 2 часов, затем инфицировали ВИЧ или опсонизированным комплементом ВИЧ (CHIV) в течение 22 часов. (A) Тепловая карта из данных транскриптома РНК seq внутриклеточных сенсоров, которые значительно повышаются или понижаются в одном или нескольких состояниях инфицирования ВИЧ, CHIV, HSV / HIV или CHSV / CHIV по сравнению с ложно обработанными DC. (B) Уровни SAMHD1, ABOBEC3G и TREX1 в DC в различных условиях инфицирования оценивали путем окрашивания клеток и анализировали с помощью проточной цитометрии. (C) cGAMP вводили экзогенно или доставляли внутриклеточно через DOTAP к DC, после чего DC оставались неэкспонированными или подвергались воздействию вместе с ВИЧ в течение 16 часов. Кроме того, одна группа DC подвергалась воздействию HSV в течение 2 часов, а затем ВИЧ или CHIV в течение 16 часов. Уровни SAMHD1, ABOBEC3G и TREX1 оценивали путем окрашивания клеток и анализировали с помощью проточной цитометрии. * p <0,05; ** p <0,005; *** р <0,0005. N = 5–8.

Обсуждение

Большое значение имеет более глубокое понимание факторов, влияющих на ВИЧ-инфекцию, и было показано, что ранее существовавшая инфекция и / или воспаление на слизистой оболочке половых органов увеличивает риск заражения ВИЧ.В случае HSV-2 риск заражения ВИЧ-инфекцией в три раза выше (2, 9, 14). Во время первичной ВИЧ-инфекции слизистой оболочки HSV-2, как инфекционные, так и нейтрализованные вирусы, а также остатки умирающих инфицированных клеток, будут влиять на местные врожденные и адаптивные иммунные ответы. ДК, расположенные в слизистой оболочке, являются одними из первых клеток, нацеленных на ВИЧ. Здесь мы стремились установить эффекты, оказываемые кондиционированием ДК HSV-2 до заражения ВИЧ. Мы обнаружили более высокую восприимчивость и уровень продуктивной ВИЧ-инфекции у ДК, подвергшихся воздействию ВПГ-2, что зависело от структурно интактной ДНК ВПГ-2 в ДК.Примечательно, что высокие уровни продукции IFN-β, индуцированные в DC воздействием HSV-2, не смогли контролировать инфекцию, поскольку IFN-β увеличивался параллельно с увеличением инфицирования ВИЧ в DC, подвергнутых двойному воздействию. Влияние HSV-2 на репликацию ВИЧ в DC не зависело от TLR2, TLR3 или IFI16, всех трех PRR, которые, как известно, активируются вирусом герпеса (55), а скорее от активации пути cGAS-STING и последующего снижения содержания белка. уровни нескольких ключевых регуляторов ВИЧ-инфекции, т. е. TREX1, SAMHD1 и ABOBEC3G, что может быть связано с протеолитической деградацией.

ДК, расположенные в слизистой оболочке, рассматриваются как мишени для ВИЧ-1, как это было показано на макаках, инфицированных SIV, и на моделях шейки матки и крайней плоти на моделях in vitro (73–75). Первоначальное взаимодействие хозяина с вирусом в слизистой оболочке также включает активацию системы комплемента (19), и как на врожденный, так и на активированный иммунитет влияет система комплемента, и комплемент может участвовать в патогенезе хронических заболеваний (76). Вирионы, передаваемые во время половой передачи в DC, должны представлять собой частицы, опсонизированные комплементом и / или комплементарными антителами, которые видны при контакте с семенной жидкостью и / или секрециями шейки матки (19).Результат нашего исследования с использованием ДК, полученных из моноцитов, который, как мы полагаем, является хорошей моделью для in vivo ДК ткани / слизистой оболочки, наблюдая аналогичные результаты для свободной и комплементарной опсонизированной инфекции ВИЧ-1 и для инфекции ВПГ-2 в ДК слизистой оболочки шейки матки. [(75) и Svanberg et al. работа в процессе]. Используемые нами ДК, происходящие из моноцитов, по-видимому, похожи на недавно определенные эпидермальные ДК CD11c +, которые являются мишенью для ВИЧ-инфекции (77). Эпидермальные CD11c + DC и клетки Лангерганса могут играть важную роль в передаче ВИЧ-1 половым путем (8, 77).Тот факт, что лишь несколько процентов ДК, подвергшихся воздействию ВИЧ и ВПГ-2, продуктивно инфицированы обоими вирусами (8), ясно указывает на то, что усиление инфицирования ДК ВИЧ требовало только контакта с вирионами ВПГ-2 или вирусной ДНК. Это создаст контекст, в котором уже существующая инфекция ВПГ-2 привлекает и предоставляет больше клеток-мишеней для ВИЧ, например, Т-лимфоциты CD4 и ДК (2, 8, 9), а также среду с микрозонами с ВПГ-2, провоспалительные цитокины и ДНК HSV-2, высвобождаемая умирающими клетками.Взятые вместе, все эти факторы создают предпосылки для ДК слизистой оболочки и делают их более восприимчивыми к продуктивной ВИЧ-инфекции.

Первоначальный анализ транскриптома показал, что все условия инфицирования имеют различные профили экспрессии с некоторым сходством между состояниями со свободными вирусами, то есть ВИЧ и ВИЧ / HSV, и между опсонизированными комплементом вирусами, то есть CHIV и CHIV / CHSV. Многочисленные пути, участвующие в противовирусных и воспалительных ответах, были сильно затронуты в DC, инфицированных свободным ВИЧ или опсонизированным комплементом или неопсонизированным HSV / ВИЧ, тогда как опсонизированные комплементом вирусы в целом активировали меньшее количество путей.Эффективное подавление активации DC опсонизированным комплементом ВИЧ должно в первую очередь быть связано с подавлением врожденных и адаптивных путей, опосредованных сигнализацией рецептора комплемента 3 (CR3), задействованной инактивированным фрагментом C3b на вирусной поверхности (20). Предварительное кондиционирование DC с помощью HSV-2 с последующей ВИЧ-инфекцией явно усиливало активацию DC по сравнению с одной только ВИЧ-инфекцией. Это должно зависеть в первую очередь от сильной и продолжительной активации, вызываемой HSV-2, поскольку только ВИЧ вызывает слабую и более временную активацию DC.

Произошла массивная активация транскрипции воспалительных и противовирусных факторов в ДК, подвергнутых воздействию ВИЧ / ВПГ, однако это не полностью отразилось на уровне белка без изменений или даже снижения уровней некоторых белков. Это соответствует нашим предыдущим наблюдениям для DC, инфицированных HSV-2 (18). Это несоответствие может быть вызвано несколькими причинами, такими как посттранскрипционная модификация, деградация белками, производными от HSV-2 (25, 56) и / или целенаправленная протеолитическая деградация белков, участвующих в клеточных процессах из-за вирусной активации клеточного стресса, такого как подавление факторов аутофагии и постпатогенной активации.Вирусы герпеса имеют широкий спектр стратегий, позволяющих избежать чувствительности врожденного иммунитета и повысить свою выживаемость. Обычные стратегии, используемые вирусами герпеса, заключаются в том, чтобы ингибировать или расщеплять белки, участвующие в противовирусных иммунных ответах (25, 48, 78). Некоторые белки HSV и вирусные некодирующие РНК могут модулировать экспрессию белка, например, предполагается, что белок UL41, кодируемый HSV, обладает способностью запускать быстрое и селективное отключение синтеза белка в клетке-хозяине для нескольких белков, включая виперин, и тезерин (79–82).

Было показано, что множественные PRR участвуют в клеточном распознавании и защите от герпесвирусов (55), когда мы тестировали TLR2 и TLR3, мы не обнаружили, что ни один из этих TLR не участвует в повышенном уровне ВИЧ-инфекции, наблюдаемом в кондиционированных HSV-2 DC. Вместо этого в недавних сообщениях указывается на активацию пути STING и его важную роль в противовирусной защите от HSV (83, 84). Поющий каскад STING может пересекать как путь TBK1 / IRF3, так и путь NFκB (85–87). Несколько сенсоров ДНК были вовлечены в активацию STING, такие как IFI16, DDX41 и cGAS, но накопленные данные ясно показали, что определение cGAS требуется для большинства типов клеток.Это верно, даже если существует сотрудничество в активации STING между IFI16 и cGAS в кератиноцитах (62), а IFI16 способствует продукции cGAS cGAMP в макрофагах человека (72). Все наши данные указывают на активацию пути cGAS STING в двойных зараженных DC. Когда дело доходит до повышенного уровня ВИЧ-инфекции, мы можем исключить участие IFI16, поскольку блокирование этого фактора не привело к снижению ВИЧ-инфекции, тогда как прямое нацеливание на STING помогло сделать то же самое. С другой стороны, мы не можем исключить участие IFI16 в обнаружении двойной инфекции и взаимодействие этого сенсора с cGAS в активации противовирусных ответов IFN-β, поскольку блокирование IFI16 снижает ответ IFN-β.Важная роль IFI16 в обнаружении внутриклеточной ДНК была ранее показана в макрофагах человека посредством усиления продукции и функции цГАМФ (72).

ВИЧ-инфекция ДК жестко регулируется и ограничивается множеством противовирусных факторов, таких как SAMHD1, APOBEC3G, TRIM5α, SLFN11 и IFITMs, которые проявляют свои эффекты на разных этапах цикла репликации ВИЧ (88–90). Эти факторы контролируют или подавляют способность ВИЧ вызывать продуктивную инфекцию SAMHD1 в качестве основного подавляющего фактора ВИЧ (90, 91).SAMHD1 ингибирует ранние стадии ВИЧ-инфекции, ограничивая синтез вирусной кДНК за счет истощения дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) (90), а деградация SAMHD1 под действием VPX ВИЧ-2 приводит к усилению инфицирования DC и продукции IFN типа I (91). ВИЧ использует 3′-репарированную экзонуклеазу 1 хозяина (TREX1), наиболее распространенную 3′-5′-ДНКазу в клетках, для связывания и разрушения избытка цитозольной дцДНК ВИЧ-1 и, таким образом, ограничения ответа IFN типа I (88). Было показано, что помимо ограничения ВИЧ-инфекции SAMHD1 и TRIM5α также участвуют в регуляции инфекции HSV-1, ограничивая репликацию ДНК (92, 93).Мы обнаружили высокую степень протеолитической деградации некоторых факторов рестрикции ВИЧ-1, включая SAMHD1, IFI16, TREX1 и APOBEC3G (88–90), в двойно экспонированных DC. Субоптимальные уровни нескольких ключевых факторов ограничения могут объяснить потерю контроля над ВИЧ-инфекцией со стороны ДК и усиление продуктивной ВИЧ-инфекции в ДК. Интересно, что активация пути cGAS-STING в DCs параллельно с воздействием ВИЧ индуцировала деградацию SAMHD1 и TREX1, но не APOBEC3G.Более того, внутриклеточная активация пути cGAS-STING с помощью cGAMP давала аналогичные эффекты на репликацию ВИЧ и продукцию цитокинов, как и предварительное кондиционирование с помощью HSV-2, указывая на важную роль этого пути в клеточной модуляции функций DC HSV-2. Активация пути STING в ДК, подвергнутых воздействию как ВИЧ, так и HSV-2, должна впоследствии привести к накоплению большего количества нуклеотидов в цитозоле из-за более низких уровней 3′-5′-экзонуклеазы TREX1 и фосфогидролазы SAMHD1, которые должны поддерживать вирусная репликация.Отсутствие деградации APOBEC3G посредством экзогенной активации cGAMP STING указывает на то, что в этом участвовали другие процессы / факторы, вызванные HSV-2, и точно определить, какие факторы еще предстоит установить, но они могут включать производные от HSV факторы или факторы, активируемые воздействием вируса. Например, открытие Marsden et al. тот факт, что TNF, продуцируемый DC, подвергнутыми воздействию HSV-2, был вовлечен в усиление ВИЧ-инфекции сторонних DC (8), указывает на то, что TNF может быть одним из факторов, участвующих в продвижении ВИЧ-инфекции в DC.

Множество сенсоров и кофакторов цитозольной ДНК, например IFI16, cGAS, STING, TBK1 и IRF3, важных для распознавания вирусных PAMP, также были нацелены на деградацию в двойных контактах с ВИЧ и ВПГ-2, но не в контакте с ВИЧ. DC, демонстрирующие прямое и / или косвенное участие HSV-2 в этом процессе. Уменьшение количества нескольких белков, участвующих в пути STING, например IFI16, cGAS, STING, TBK1 и IRF3, вероятно, было связано с вирусной активацией пути STING (58, 94) и / или прямой деградацией вирусных белков (95) .Чтобы проанализировать это дальше, необходимы будущие исследования фосфорилирования и локализации этих белков. Некоторые белки ДНК-вируса могут расщеплять или разрушать датчики ДНК. Например, сенсор дцДНК IFI16, который активирует ответы IFN-β и формирует инфламмасому, разрушается в клетках, инфицированных HSV-1, под действием протеасомного таргетинга ICP0 (48) и в клетках с литической саркомой Капоши-ассоциированной герпесвирусной инфекцией (25). STING и cGAS также являются обычными мишенями для белков ДНК-вирусов, которые разрушают эти факторы или мешают их передаче сигналов ниже по ходу (57, 70, 96–98).В ДК, подвергнутых двойному воздействию, уровни cGAS были ниже по сравнению с неинфицированными или одиночными ВИЧ-инфицированными клетками, и это должно снизить продукцию cGAMP и активацию STING в результате клеточной регуляции и контроля этого фактора после активации ( 56). Несколько вирусов распознаются и регулируются путем STING, включая HSV-1, HSV-2 и HIV-1 (29, 56). ДНК ВИЧ-1 может распознаваться cGAS и путем STING (29), однако этому противодействует и предотвращается капсид ВИЧ-1 путем привлечения клеточных белков, например.g., циклофилин A и TRIM5α (99). HSV-1 противодействует пути STING-cGAS с помощью нескольких белков, включая ICP27, который может ингибировать экспрессию IFN типа I, воздействуя на сигнальный комплекс STING (56). Ясно, что и ВИЧ, и HSV-2 регулируются путем STING и разработали стратегии для установления инфекции путем подавления активации STING и последующих ответов IFN типа I.

Мы обнаружили и ранее показали (20), что в ДК, полученных из моноцитов, воздействие одного только ВИЧ-1 действительно может вызвать всплеск низкого уровня IFN-β, этот ответ временный и слабый по сравнению со многими другими вирусами, включая ВПГ-2 (18).Мы думаем, что это открытие согласуется с предыдущими исследованиями Harman et al. и Gringhuis et al. которые демонстрируют, что ВИЧ-1 обладает способностью с помощью нескольких механизмов вмешиваться в продукцию IFN-β и избегать противовирусной защиты хозяина (100–102). Двойное воздействие индуцировало высокий уровень противовирусного фактора IFN-β и последующих ISG, таких как MX1 и MX2, в DC через активацию ДНК HSV-2 пути STING. Высокий уровень продукции IFNβ в ДК, подвергнутых двойному свободному и комплементарному опонированию ВИЧ / ВПГ, не смог блокировать ВИЧ-инфекцию, но очевидно, что он подавлял инфекцию, поскольку ВИЧ-инфекция была дополнительно повышена в ДК, где IFN-β был подавлен. путем ингибирования ДНК-сенсора IFI16.Это продемонстрировало балансирующее действие пути STING, играющего роль как в усилении ВИЧ-инфекции, так и в контроле уровня инфекции посредством активации IFN типа I. Ранее мы установили, что ВИЧ-1 может индуцировать продукцию IFN-β в DC зависимым от IRF1 / 7 образом, тогда как опсонизированный комплементом ВИЧ активировал IRF3, но это не давало продукции IFN-β или приводило к ее очень низкому уровню (20). Это, вероятно, связано с подавлением CR3, индуцированным опсонизированным комплементом вирусом, и тем, что подавление CR3 IFN-β перекрывается сильной активацией, которую HSV-2 индуцирует в DC.

Мы ясно демонстрируем, что для увеличения ВИЧ-инфекции, зависимого от HSV-2, требуется интактная дцДНК HSV-2, но не активная репликация ДНК HSV. Клеточная поддержка продуктивной ВИЧ-инфекции должна быть обусловлена ​​регуляцией и протеолитической деградацией факторов рестрикции ВИЧ, то есть SAMHD1, APOBEC3G, IFI16 и TREX1. Механизм, ответственный за протеолитическую деградацию белков SAMHD1, TREX1 и APOBEC3G, по-видимому, облегчается активацией пути STING, который, насколько нам известно, на сегодняшний день не описан, а также действием одного или нескольких белков HSV-2. .Деградация нескольких регуляторных факторов ВИЧ, наблюдаемая при активации STING через путь cGAMP-cGAS путем добавления экзогенного cGAMP, подтверждает роль пути STING в деградации этих белков в двойных контактах с ВПГ ВИЧ. Кроме того, противовирусные и воспалительные пути, активируемые одним ВИЧ или двойным воздействием ВИЧ / ВПГ, имели различную форму в присутствии или в отсутствие молекул комплемента. Эти данные продемонстрировали, что внутриклеточное перепрограммирование HSV-2 увеличивает способность ВИЧ инфицировать DC и обеспечивает условную микросреду, благоприятную для передачи ВИЧ и возникновения инфекции.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в GEO — доступ GSE140612. Другие необработанные данные, подтверждающие выводы этой рукописи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок любому квалифицированному исследователю.

Заявление об этике

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены Шведским этическим советом по надзору за соблюдением этических норм M173-07 и M75-08 / 2008. Письменное информированное согласие на участие не требовалось для этого исследования в соответствии с национальным законодательством и институциональными требованиями.

Авторские взносы

Исследования, разработанные EC, CS и ML. EC, RE, CS, PB, MK, JH и SN провели исследования. KE предоставил новые реагенты и аналитические инструменты. KO, EC, RE, CS, KE, ES и ML проанализировали данные. Документ написали EC, KE, CS, ES и ML. ML курировал проект.

Финансирование

Эта работа была поддержана: AI52731, Шведский исследовательский совет, Фонд исследований шведских врачей против СПИДа, Шведское агентство международного сотрудничества в области развития, SIDA SARC, VINNMER for Vinnova, Исследовательский фонд больницы Университета Линчёпинга, CALF, Шведское медицинское общество и Совет медицинских исследований Юго-Восточной Швеции по ML.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Вычисления для RNAseq были выполнены на ресурсах, предоставленных SNIC через Уппсальский многопрофильный центр передовых вычислительных наук (UPPMAX) в рамках проекта b2015293.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.02889/full#supplementary-material

Список литературы

2. Фриман Э. Э., Вайс Х. А., Глинн Дж. Р., Кросс П. Л., Уитворт Дж. А., Хейс Р. Дж.. Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 2, увеличивает заражение ВИЧ среди мужчин и женщин: систематический обзор и метаанализ продольных исследований. СПИД . (2006) 20: 73–83. DOI: 10.1097 / 01.aids.0000198081.09337.a7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Вальд А., Линк К.Риск инфицирования вирусом иммунодефицита человека у лиц, инфицированных вирусом простого герпеса 2-го типа: метаанализ. Дж. Заражение Дис. . (2002) 185: 45–52. DOI: 10.1086 / 338231

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Schiffer JT, Swan DA, Corey L, Wald A. Быстрое распространение вируса и короткий период полувыведения лекарства объясняют неполную эффективность существующих противовирусных агентов, направленных против вируса простого герпеса 2. Противомикробные агенты Chemother . (2013) 57: 5820–9.DOI: 10.1128 / AAC.01114-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Schiffer JT, Swan DA, Magaret A, Schacker TW, Wald A, Corey L. Математическое моделирование предсказывает, что повышенное выделение HSV-2 у ВИЧ-1 инфицированных людей происходит из-за плохого иммунологического контроля в ганглиях и слизистой оболочке гениталий. PLOS ONE . (2016) 11: e0155124. DOI: 10.1371 / journal.pone.0155124

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Марсден В., Донахи Х., Бертрам К.М., Харман А.Н., Наср Н., Кеошкериан Э. и др.Дендритные клетки, инфицированные вирусом простого герпеса 2 типа, продуцируют TNF-альфа, который усиливает экспрессию CCR5 и стимулирует продукцию ВИЧ из соседних инфицированных клеток. Дж Иммунол . (2015) 194: 4438–45. DOI: 10.4049 / jimmunol.1401706

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. де Йонг М.А., де Витте Л., Тейлор М.Э., Гейтенбек ТБ. Вирус простого герпеса 2 типа повышает восприимчивость к ВИЧ-1, влияя на функцию клеток Лангерганса. Дж Иммунол . (2010) 185: 1633–41.DOI: 10.4049 / jimmunol.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Сартори Э., Калистри А., Салата С., Дель Веккио С., Палу Г., Паролин С. Инфекция вируса простого герпеса 2 типа увеличивает проникновение вируса иммунодефицита человека 1 типа в первичные макрофаги человека. Вирол J . (2011) 8: 166. DOI: 10.1186 / 1743-422X-8-166

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Реббапрагада А., Вачихи К., Петтенгель С., Сандерджи С., Хьюибнер С., Джаоко В. и др.Отрицательная синергия слизистой оболочки между Herpes simplex типа 2 и ВИЧ в женских половых путях. СПИД . (2007) 21: 589–98. DOI: 10.1097 / QAD.0b013e328012b896

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Чжу Дж., Хладик Ф., Вудворд А., Клок А., Пэн Т., Джонстон С. и др. Сохранение рецептор-положительных клеток ВИЧ-1 после реактивации ВПГ-2 является потенциальным механизмом увеличения заражения ВИЧ-1. Нат Мед . (2009) 15: 886–92. DOI: 10,1038 / нм.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Мартинелли Э., Тарингер Х., Франк И., Артос Дж., Пятак М. мл., Лифсон Дж. Д. и др. Инфекция дендритных клеток HSV-2 усиливает высокочувствительную клетку-мишень ВИЧ-1. PLoS Pathog. (2011) 7: e1002109. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1002109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Гуд Д., Чыонг Р., Виллегас Дж., Календа Дж., Герра-Перес Н., Пятак М. и др. Повышение экспрессии альфа4бета7, вызванное ВПГ-2, коррелирует с повышенной восприимчивостью к вагинальной инфекции SHIV (SF162P3). ПЛоС Патог . (2014) 10: e1004567. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1004567

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. де Йонг М.А., де Витте Л., Аудхофф М.Дж., Гринхейс С.И., Галлай П., Гейтенбек ТБ. Агонисты TNF-альфа и TLR повышают восприимчивость к передаче ВИЧ-1 клетками Лангерганса человека ex vivo . Дж Клин Инвест . (2008) 118: 3440–52. DOI: 10.1172 / JCI34721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16.Bouhlal H, Chomont N, Haeffner-Cavaillon N, Kazatchkine MD, Belec L, Hocini H. Опсонизация ВИЧ-1 комплементом спермы усиливает инфицирование эпителиальных клеток человека. Дж Иммунол . (2002) 169: 3301–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.169.6.3301

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Рейс Мачадо Дж, да Силва М.В., Кавеллани С.Л., дос Рейс М.А., Монтейро М.Л., Тейшейра Вде П. и др. Иммунитет слизистых оболочек женских половых путей, ВИЧ / СПИД. Биомед Рес Инт .(2014) 2014: 350195. DOI: 10.1155 / 2014/350195

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Криши Э., Эллегард Р., Нистром С., Рондаль Э., Серрандер Л., Бергстром Т. и др. Опсонизация комплемента способствует инфицированию дендритных клеток человека вирусом простого герпеса 2. Дж Вирол . (2016) 90: 4939–50. DOI: 10.1128 / JVI.00224-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Штойбер Н., Банки З., Вильфлингседер Д., Диерих М.П.Взаимодействие комплемента с ВИЧ на всех этапах вирусного патогенеза. Вакцина . (2008) 26: 3046–54. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2007.12.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Эллегард Р., Криши Э., Бургенер А., Шовалл С., Бирс К., Вестмакотт Г. и др. Опсонизация ВИЧ-1 комплементом приводит к снижению противовирусных и воспалительных реакций незрелых дендритных клеток через CR3. Дж Иммунол . (2014) 193: 4590–601. DOI: 10.4049 / jimmunol.1401781

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Байтай З., Спет С., Эрдей А., Диерих М.П. Передний край: продуктивная инфекция дендритных клеток ВИЧ-1 через рецептор комплемента 3 типа (CR3, CD11b / CD18). Дж Иммунол . (2004) 173: 4775–8. DOI: 10.4049 / jimmunol.173.8.4775

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Сайфуддин М., Паркер С.Дж., Пиплс М.Э., Горный М.К., Золла-Пазнер С., Гассеми М. и др. Роль связанных с вирионом гликозилфосфатидилинозитол-связанных белков CD55 и CD59 в устойчивости к комплементу производных клеточной линии и первичных изолятов ВИЧ-1. J Exp Med . (1995) 182: 501–9. DOI: 10.1084 / jem.182.2.501

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Bouhlal H, Chomont N, Requena M, Nasreddine N, Saidi H, Legoff J, et al. Опсонизация ВИЧ комплементом усиливает инфицирование дендритных клеток и перенос вируса в CD4 Т-клетки CR3- и DC-SIGN-зависимым образом. Дж Иммунол . (2007) 178: 1086–95. DOI: 10.4049 / jimmunol.178.2.1086

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24.Мельхьорсен Дж., Ринтахака Дж., Соби С., Хоран К.А., Полтаджайнен А., Остергаард Л. и др. Раннее врожденное распознавание вируса простого герпеса в первичных макрофагах человека опосредуется через MDA5 / MAVS-зависимые и независимые от MDA5 / MAVS / РНК-полимеразы III пути. Дж Вирол . (2010) 84: 11350–8. DOI: 10.1128 / JVI.01106-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Рой А., Датта Д., Икбал Дж., Пизано Дж., Гжиши О., Ансари М.А. и др. Сенсор ДНК ядерного врожденного иммунитета IFI16 разрушается во время литической реактивации герпесвируса Капоши, связанного с саркомой (KSHV): роль IFI16 в поддержании латентности KSHV. Дж Вирол . (2016) 90: 8822–41. DOI: 10.1128 / JVI.01003-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Датта Д., Датта С., Веттил М.В., Рой А., Ансари М.А., Икбал Дж. И др. BRCA1 регулирует опосредованное IFI16 врожденное ядерное восприятие ДНК вируса герпеса и последующую индукцию врожденного инфламмасомы и ответов интерферона-β. ПЛоС Патог . (2015) 11: e1005030. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1005030

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27.Орзалли М.Х., Брукема Н.М., Дайнер Б.А., Хэнкс, округ Колумбия, Элде, Северная Каролина, Кристя И.М. и др. cGAS-опосредованная стабилизация IFI16 способствует врожденной передаче сигналов во время инфицирования вирусом простого герпеса. Proc Natl Acad Sci USA . (2015) 112: E1773–81. DOI: 10.1073 / pnas.1424637112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Хансен К., Прабакаран Т., Лаустсен А., Йоргенсен С.Е., Рахбек С.Х., Дженсен С.Б. и др. Listeria monocytogenes индуцирует экспрессию IFNβ посредством IFI16-, cGAS- и STING-зависимого пути. EMBO J . (2014) 33: 1654–66. DOI: 10.15252 / embj.201488029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Гао Д., Ву Дж., Ву Ю. Т., Ду Ф, Аро С., Ян Н. и др. Циклическая GMP-AMP-синтаза является сенсором врожденного иммунитета ВИЧ и других ретровирусов. Наука . (2013) 341: 903–6. DOI: 10.1126 / science.1240933

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Якобсен М.Р., Бак Р.О., Андерсен А., Берг Р.К., Йенсен С.Б., Тенгчуан Дж. И др.IFI16 распознает формы ДНК лентивирусного цикла репликации и контролирует репликацию ВИЧ-1. Proc Natl Acad Sci USA . (2013) 110: E4571–80. DOI: 10.1073 / pnas.1311669110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Шон Э., Харанди А.М., Нордстром I, Холмгрен Дж., Эрикссон К. Вакцинация дендритными клетками защищает мышей от летальности, вызванной инфекцией вируса простого генитального герпеса 2 типа. Дж Репрод Иммунол . (2001) 50: 87–104. DOI: 10.1016 / S0165-0378 (00) 00094-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Россио Дж. Л., Эссер М. Т., Сурьянараяна К., Шнайдер Д. К., Бесс Дж. В. мл., Васкес Г. М. и др. Инактивация инфекционности вируса иммунодефицита человека 1 типа с сохранением конформационной и функциональной целостности поверхностных белков вириона. Дж Вирол . (1998) 72: 7992–8001.

PubMed Аннотация | Google Scholar

34. Куч О., Бенвенист Э. Н., Шоу Г. М., Леви Д. Н..Прямой и количественный одноклеточный анализ реактивации вируса иммунодефицита человека 1 типа с латентного периода. Дж Вирол . (2002) 76: 8776–86. DOI: 10.1128 / JVI.76.17.8776-8786.2002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Леви Д. Н., Альдрованди Г. М., Куч О., Шоу Г. М.. Динамика рекомбинации ВИЧ-1 в его естественных клетках-мишенях. Proc Natl Acad Sci USA . (2004) 101: 4204–9. DOI: 10.1073 / pnas.0306764101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Tjomsland V, Ellegard R, Che K, Hinkula J, Lifson JD, Larsson M. Комплементарная опсонизация ВИЧ-1 усиливает захват дендритными клетками и включает в себя семейства рецепторов эндоцитарного лектина и интегрина. PLOS ONE . (2011) 6: e23542. DOI: 10.1371 / journal.pone.0023542

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Вандесомпеле Дж., Де Претер К., Паттин Ф., Поппе Б., Ван Рой Н., Де Паэпе А. и др. Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля. Genome Biol. (2002) 3: 0034. DOI: 10.1186 / GB-2002-3-7-research0034

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Бабрахам-биоинформатика. FastQC: инструмент контроля качества для данных последовательности с высокой пропускной способностью . Кембридж: Бабрахам-биоинформатика (2017).

Google Scholar

41. Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренкоу Дж., Залески С., Джа С. и др. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика .(2013) 29: 15–21. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bts635

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: эффективная программа общего назначения для сопоставления считываний последовательностей с геномными особенностями. Биоинформатика . (2014) 30: 923–30. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btt656

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Голдвич А., Пречтель А.Т., Мюль-Зурбес П., Панграц Н.М., Стоссель Н., Романи Н. и др.Вирус простого герпеса типа I (HSV-1) реплицируется в зрелых дендритных клетках, но может переноситься только в зависимости от контакта между клетками. Дж Лейкок Биол . (2011) 89: 973–9. DOI: 10.1189 / jlb.0310180

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Abaitua F, Hollinshead M, Bolstad M, Crump CM, O’Hare P. Сигнал ядерной локализации в герпесвирусном белке VP1-2 важен для инфицирования через путь капсида к ядерной поре. Дж Вирол .(2012) 86: 8998–9014. DOI: 10.1128 / JVI.01209-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Mikloska Z, Bosnjak L, Cunningham AL. Незрелые дендритные клетки, полученные из моноцитов, продуктивно инфицированы вирусом простого герпеса типа 1. J Virol . (2001) 75: 5958–64. DOI: 10.1128 / JVI.75.13.5958-5964.2001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Орзалли М.Х., ДеЛука Н.А., Книпе Д.М. Ядерная индукция IFI16 передачи сигналов IRF-3 во время герпесвирусной инфекции и деградация IFI16 вирусным белком ICP0. Proc Natl Acad Sci USA . (2012) 109: E3008–17. DOI: 10.1073 / pnas.1211302109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Лю Ю., Ли М., Чжан Д., Чжан М., Ху К. Гликопротеин gD HSV-2 нацелен на домен CC тетерина и способствует его деградации через лизосомный путь. Вирол J . (2016) 13: 154. DOI: 10.1186 / s12985-016-0610-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Ушидзима Ю., Луо Ц., Камакура М., Госима Ф., Кимура Х., Нишияма Ю.Вирус простого герпеса UL56 взаимодействует с убиквитинлигазой Itch семейства Nedd4 и регулирует его. Вирол J . (2010) 7: 179. DOI: 10.1186 / 1743-422X-7-179

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Стефаниду М., Рамос И., Мас Касулло В., Трепаниер Дж. Б., Розенбаум С., Фернандес-Сесма А. и др. Вирус простого герпеса 2 (HSV-2) предотвращает созревание дендритных клеток, индуцирует апоптоз и запускает высвобождение провоспалительных цитокинов: потенциальные связи с синергией HSV-HIV. Дж Вирол . (2013) 87: 1443–53. DOI: 10.1128 / JVI.01302-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Сато А., Линехан М.М., Ивасаки А. Двойное распознавание вирусов простого герпеса TLR2 и TLR9 в дендритных клетках. Proc Natl Acad Sci USA . (2006) 103: 17343–8. DOI: 10.1073 / pnas.0605102103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Свенссон А., Тунбэк П., Нордстрем И., Падюков Л., Эрикссон К.Полиморфизм Toll-подобного рецептора 3 придает естественную устойчивость к инфекции вируса простого герпеса 2 типа. Дж. Gen Virol . (2012) 93: 1717–24. DOI: 10.1099 / vir.0.042572-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Триантафилу К., Эриилмазлар Д., Триантафилу М. Активация вируса простого герпеса 2 в клетках влагалища включает Toll-подобные рецепторы 2 и 9 и датчики ДНК DAI и IFI16. Am J Obstet Gynecol . (2014) 210: 122.e1–10.DOI: 10.1016 / j.ajog.2013.09.034

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Christensen MH, Jensen SB, Miettinen JJ, Luecke S, Prabakaran T, Reinert LS, et al. HSV-1 ICP27 нацелен на активированный TBK1 сигналсом STING, чтобы ингибировать индуцированную вирусом экспрессию IFN типа I. EMBO J . (2016) 35: 1385–99. DOI: 10.15252 / embj.201593458

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Агирре С., Маэстре А.М., Пагни С., Патель Дж. Р., Сэвидж Т., Гутман Д. и др.DENV подавляет продукцию IFN типа I в инфицированных клетках путем расщепления STING человека. ПЛоС Патог . (2012) 8: e1002934. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1002934

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Конно Х., Конно К., Парикмахер Г.Н. Циклические динуклеотиды запускают фосфорилирование ULK1 (ATG1) STING для предотвращения устойчивой передачи сигналов врожденного иммунитета. Ячейка . (2013) 155: 688–98. DOI: 10.1016 / j.cell.2013.09.049

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59.Хиггс Р., Ни Габанн Дж., Бен Ларби Н., Брин Е.П., Фицджеральд К.А., Джеффрис Калифорния. Убиквитинлигаза E3 Ro52 отрицательно регулирует постпатогенное распознавание продукции IFN-бета посредством полиубиквитин-опосредованной деградации IRF3. Дж Иммунол . (2008) 181: 1780–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.181.3.1780

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Цуй Дж., Ли Й, Чжу Л., Лю Д., Сунъян З., Ван Х. Ю. и др. NLRP4 негативно регулирует передачу сигналов интерферона I типа, направляя киназу TBK1 для деградации через убиквитинлигазу DTX4. Нат Иммунол . (2012) 13: 387–95. DOI: 10.1038 / ni.2239

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Almine JF, O’Hare CA, Dunphy G, Haga IR, Naik RJ, Atrih A, et al. IFI16 и cGAS взаимодействуют в активации STING во время зондирования ДНК в кератиноцитах человека. Нац Коммуна . (2017) 8: 14392. DOI: 10.1038 / ncomms14392

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Diner BA, Lum KK, Toettcher JE, Cristea IM.Сенсоры вирусной ДНК IFI16 и циклическая GMP-AMP-синтаза обладают разными функциями в регулировании экспрессии вирусных генов, иммунной защиты и апоптотических реакций во время герпесвирусной инфекции. МБИО . (2016) 7: e01553–16. DOI: 10.1128 / mBio.01553-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Luecke S, Holleufer A, Christensen MH, Jonsson KL, Boni GA, Sorensen LK, et al. cGAS активируется ДНК в зависимости от длины. EMBO Rep .(2017) 18: 1707–15. DOI: 10.15252 / embr.201744017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Kaminski JJ, Schattgen SA, Tzeng TC, Bode C, Klinman DM, Fitzgerald KA. Синтетические олигодезоксинуклеотиды, содержащие супрессивные мотивы TTAGGG, ингибируют активацию инфламмасомы AIM2. Дж Иммунол . (2013) 191: 3876–83. DOI: 10.4049 / jimmunol.1300530

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Steinhagen F, Zillinger T, Peukert K, Fox M, Thudium M, Barchet W. и др.Супрессивные олигодезоксинуклеотиды, содержащие мотивы TTAGGG, ингибируют активацию cGAS в моноцитах человека. евро J Immunol . (2018) 48: 605–11. DOI: 10.1002 / eji.201747338

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

67. Ли Т., Чен Дж., Криста И.М. Тегументный белок цитомегаловируса человека pUL83 ингибирует опосредованное IFI16 распознавание ДНК для уклонения от иммунитета. Клеточный микроб-хозяин . (2013) 14: 591–9. DOI: 10.1016 / j.chom.2013.10.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68.Биолатти М., Делль’Осте В., Паутассо С., Гуглиси Ф., фон Эйнем Дж., Крапп С. и др. Тегументный белок цитомегаловируса человека pp65 (pUL83) подавляет продукцию интерферона I типа, инактивируя ДНК-сенсор cGAS, не влияя на STING. Дж Вирол . (2018) 92: e01774–17. DOI: 10.1128 / JVI.01774-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

71. Антониос Д., Руссо П., Ларанге А., Кердин-Ромер С., Палларди М. Механизмы синтеза ИЛ-12 дендритными клетками человека, обработанными химическим сенсибилизатором NiSO4. Дж Иммунол . (2010) 185: 89–98. DOI: 10.4049 / jimmunol.02

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

72. Йонссон К.Л., Лаустсен А., Крапп С., Шкипер К.А., Тавачельвам К., Хоттер Д. и др. IFI16 необходим для определения ДНК в макрофагах человека, способствуя выработке и функции цГАМФ. Нац Коммуна . (2017) 8: 14391. DOI: 10.1038 / ncomms14391

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Ху К., Фрэнк И., Уильямс В., Сантос Дж. Дж., Уоттс П., Гриффин Г. Е. и др.Блокада рецепторов прикрепления и слияния подавляет инфицирование ВИЧ-1 тканью шейки матки человека. J Exp Med . (2004) 199: 1065–75. DOI: 10.1084 / jem.20022212

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74. Zhou Z, Barry de Longchamps N, Schmitt A., Zerbib M, Vacher-Lavenu MC, Bomsel M, et al. Эффективное проникновение ВИЧ-1 во внутреннюю крайнюю плоть опосредуется повышенным уровнем CCL5 / RANTES, который привлекает Т-клетки и способствует образованию конъюгата с клетками Лангерганса. ПЛоС Патог .(2011) 7: e1002100. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1002100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

75. Tjomsland V, Ellegard R, Kjolhede P, Wodlin NB, Hinkula J, Lifson JD, et al. Блокирование интегринов подавляет инфицирование ВИЧ-1 иммунных клеток слизистой оболочки шейки матки человека свободными и опсонизированными комплементом вирионами. евро J Immunol . (2013) 43: 2361–72. DOI: 10.1002 / eji.201243257

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

77.Бертрам К.М., Боттинг Р.А., Бахарлу Х., Родс Дж. В., Рана Х., Грэм Дж. Д. и др. Идентификация эпидермальных дендритных клеток человека, передающих CD11c (+). Нац Коммуна . (2019) 10: 2759. DOI: 10.1038 / s41467-019-10697-w

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

78. Куше-Лоренко Д., Андерсон Г., Слоан Э, Орр А., Эверетт Р. Д.. Вирусная убиквитинлигаза ICP0 не является ни достаточной, ни необходимой для деградации сенсора клеточной ДНК IFI16 во время инфицирования вирусом простого герпеса 1. Дж Вирол . (2013) 87: 13422–32. DOI: 10.1128 / JVI.02474-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

79. Эсклатин А, Таддео Б, Ройзман Б. Белок UL41 вируса простого герпеса опосредует селективную стабилизацию или деградацию клеточных мРНК. Proc Natl Acad Sci USA . (2004) 101: 18165–70. DOI: 10.1073 / pnas.0408272102

CrossRef Полный текст | Google Scholar

80. Шен Г, Ван К., Ван С., Цай М., Ли М.Л., Чжэн К.Вирус простого герпеса 1 противодействует виперину через свой вирионный белок-хозяин UL41. Дж Вирол . (2014) 88: 12163–6. DOI: 10.1128 / JVI.01380-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

81. Зеннер Х.Л., Маурисио Р., Бантинг Дж., Крамп С.М.. Вирус простого герпеса 1 противодействует ограничению тетерина за счет своей вирионной активности выключения хозяина. Дж Вирол . (2013) 87: 13115–23. DOI: 10.1128 / JVI.02167-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

82.Маккаскилл Дж. Л., Рессел С., Альбер А., Редфорд Дж., Пауэр Ю. Ф., Шварце Дж. И др. Широкий спектр ингибирования респираторной вирусной инфекции с помощью имитаторов микроРНК, направленных на передачу сигналов p38 MAPK. Мол тер нуклеиновых кислот . (2017) 7: 256–66. DOI: 10.1016 / j.omtn.2017.03.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

83. Дешам Т., Каламвоки М. Внеклеточные везикулы, высвобождаемые клетками, инфицированными вирусом простого герпеса 1, блокируют репликацию вируса в клетках-реципиентах зависимым от STING образом. Дж Вирол . (2018) 92: e01102–18. DOI: 10.1128 / JVI.01102-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

84. Skouboe MK, Knudsen A, Reinert LS, Boularan C, Lioux T, Perouzel E, et al. Агонисты СТИНГА обеспечивают взаимодействие противовирусных препаратов между клетками человека и обеспечивают защиту от генитального герпеса у мышей. ПЛоС Патог . (2018) 14: e1006976. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006976

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

85.Fang R, Wang C, Jiang Q, Lv M, Gao P, Yu X и ​​др. NEMO-IKKβ необходимы для активации IRF3 и NF-κB в пути cGAS-STING. Дж Иммунол . (2017) 199: 3222–33. DOI: 10.4049 / jimmunol.1700699

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

86. Эйб Т., Парикмахер Г.Н. Опосредованная цитозольной ДНК, STING-зависимая индукция провоспалительного гена требует канонической активации NF-kappaB через TBK1. Дж Вирол . (2014) 88: 5328–41. DOI: 10.1128 / JVI.00037-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

87. Като К., Исии Р., Гото Е., Иситани Р., Токунага Ф., Нуреки О. Структурный и функциональный анализ ДНК-зондирования и иммунной активации человеческим cGAS. PLOS ONE . (2013) 8: e76983. DOI: 10.1371 / journal.pone.0076983

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

88. Yan N, Regalado-Magdos AD, Stiggelbout B, Lee-Kirsch MA, Lieberman J. Цитозольная экзонуклеаза TREX1 ингибирует врожденный иммунный ответ на вирус иммунодефицита человека 1 типа. Нат Иммунол . (2010) 11: 1005–13. DOI: 10.1038 / ni.1941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

90. Laguette N, Sobhian B, Casartelli N, Ringeard M, Chable-Bessia C, Segeral E, et al. SAMHD1 представляет собой специфический для дендритных и миелоидных клеток фактор рестрикции ВИЧ-1, которому противодействует Vpx. Природа . (2011) 474: 654–7. DOI: 10.1038 / nature10117

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

91. Hertoghs N, van der Aar AM, Setiawan LC, Kootstra NA, Gringhuis SI, Geijtenbeek TB.Деградация SAMHD1 усиливает активное подавление созревания дендритных клеток ВИЧ-1. Дж Иммунол . (2015) 194: 4431–7. DOI: 10.4049 / jimmunol.1403016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

92. Ким Е.Т., Уайт Т.Э., Брандариз-Нуньес А., Диас-Грифферо Ф., Вайцман, доктор медицины. SAMHD1 ограничивает вирус простого герпеса 1 в макрофагах, ограничивая репликацию ДНК. Дж Вирол . (2013) 87: 12949–56. DOI: 10.1128 / JVI.02291-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

93.Reszka N, Zhou C, Song B, Sodroski JG, Knipe DM. Белки обезьяны TRIM5α снижают репликацию вируса простого герпеса. Вирусология . (2010) 398: 243–50. DOI: 10.1016 / j.virol.2009.11.041

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

94. Гонугунта В.К., Сакаи Т., Покатаев В., Ян К., Ву Дж., Доббс Н. и др. Опосредованная торговлей людьми деградация STING требует сортировки до подкисленных эндолизосом и может быть нацелена на усиление противоопухолевого ответа. Сотовый представитель .(2017) 21: 3234–42. DOI: 10.1016 / j.celrep.2017.11.061

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

96. Агирре С., Лутра П., Санчес-Апарисио М.Т., Маэстре А.М., Патель Дж., Ламот Ф. и др. Белок NS2B вируса денге нацелен на деградацию cGAS и предотвращает зондирование митохондриальной ДНК во время инфекции. Нат Микробиол . (2017) 2: 17037. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2017.37

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

97.Sun C, Schattgen SA, Pisitkun P, Jorgensen JP, Hilterbrand AT, Wang LJ, et al. Уклонение от врожденного цитозольного восприятия ДНК гамма-герпесвирусом способствует установлению скрытой инфекции. Дж Иммунол . (2015) 194: 1819–31. DOI: 10.4049 / jimmunol.1402495

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

98. Wu JJ, Li W, Shao Y, Avey D, Fu B, Gillen J, et al. Ингибирование зондирования ДНК cGAS белком вириона герпесвируса. Клеточный микроб-хозяин .(2015) 18: 333–44. DOI: 10.1016 / j.chom.2015.07.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

99. Rasaiyaah J, Tan CP, Fletcher AJ, Price AJ, Blondeau C., Hilditch L, et al. ВИЧ-1 уклоняется от распознавания врожденным иммунитетом за счет набора специфических кофакторов. Природа . (2013) 503: 402–5. DOI: 10.1038 / природа12769

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

100. Харман А.Н., Лай Дж., Турвилл С., Самараджива С., Грей Л., Марсден В. и др.ВИЧ-инфекция дендритных клеток нарушает путь индукции IFN через IRF-1 и подавляет продукцию IFN типа 1. Кровь . (2011) 118: 298–308. DOI: 10.1182 / кровь-2010-07-297721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

101. Харман А.Н., Наср Н., Фитхам А., Галоян А., Альшехри А.А., Рамбуквелле Д. и др. ВИЧ блокирует индукцию интерферона в дендритных клетках и макрофагах человека за счет нарушения регуляции TBK1. Дж Вирол . (2015) 89: 6575–84. DOI: 10.1128 / JVI.00889-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

102. Gringhuis SI, Hertoghs N, Kaptein TM, Zijlstra-Willems EM, Sarrami-Forooshani R, Sprokholt JK, et al. ВИЧ-1 блокирует сигнальный адаптер MAVS, чтобы избежать противовирусной защиты хозяина после восприятия абортивной РНК ВИЧ-1 хеликазой DDX3 хозяина. Нат Иммунол . (2017) 18: 225–35. DOI: 10.1038 / ni.3647

CrossRef Полный текст | Google Scholar

(PDF) Иракская система распознавания валюты с использованием среднего цвета RGB и HSV

13 M.М. Азиз — Иракская валюта…. 2016

цвета, затем K-среднее используется для кластеризации изображения на несколько

классов. Найдена гистограмма HSV, а для определения сходства изображения

используется квадрат хи (Banga & Dadwal, 2012). оценить уровень зрелости на основе сходства изображений.

ПРЕДЛАГАЕМАЯ СИСТЕМА

Подготовка базы данных

Идея этой системы заключается в том, что текущее изображение вводится в систему

в цифровом формате с помощью сканера и сравнивается с текущим изображением

в базе данных.База данных, которая его использует, должна быть хорошо подготовлена ​​

, а хранящиеся изображения должны иметь разные классы, а

охватывать все классы валютной бумаги. База данных должна включать

изображений для всех иракских денежных знаков для шести классов (250, 500,

Ambayo kwa kweli ina maana « Hisia ya umuhimu » Neno hili linaweza kupatikana mara nyingi kwenye vikao mbalimbali vya mtandao wa vijana, mitandao ya kijamii na michezo ya mata-900: «Strike19» Counter20tandaa: 900 «Counter20tandaa: 900″ Counter20tandao » Global. »,« Ligi ya waliobobea. »на кадхалика. Aidha, utani kuhusu CHSV переоценил kuwa Meme halisi ya virusi, ambayo sasa inaweza kupatikana kwenye mtandao.

Nini CHSV — расшифровка без ошибок.

Maneno rahisi, CHSV ni Maneno ya kawaida () ya «maana ya umuhimu wake», ambayo hutumiwa katika slang ya vijana kuamua kiwango cha mtazamo wake wa mtu. Кама шерия, нено хили линатумива ква кусирикиана на манэно «переоценена» ау «недооценена», амбайо ква хийо инаоньеша мту кама амбае анаджишугулиша йеневэ мухиму сана ау кудхараулива мвеньеве.

Mifano ya kutumia muda wa CSV katika hotuba:

• — !!! Ндиё, уна нгуву шана;
• — ЧСВ яко имешука, иве рахиси;
• — Kuimarisha ehs yake kutokana na udhalilishaji wa wengine;
• — Рафики, ндиё, уна ЧСВ илийопунгуа.Wewe wazi wazi mwenyewe.

Нини ЧСВ iliyojaa.

Кама ilivyo tayari kuwa wazi kutokana на ufafanuzi, вату wenye CHSV ulioingizwa, hawa ni wahusika ambao wanajiona kuwa wanadamu muhimu sana. Wanaamini kwamba watu wanaowazunguka ni muhimu sana na wanapaswa kuongezeka kwa makini na uaminifu. Кама шерия, вату хао ни куджиамини сана на кузингатия маони яо ни мухиму ту на сахихи. Мара ньинги hisia ya juu ya umuhimu wake inaweza kuongozwa na Khamsky au tabia ya uasherati.Kwa asili, wana wao wenyewe na kupotosha. Faida pekee inabakia kuwa wahusika кама hawawezi kupatikana mara chache katika maisha halisi. Mazingira kuu ya makazi yao ni просторы ya mtandao, ambapo unaweza kutukana kabisa na kuwadhalilisha watu kuongeza CHSV

Nini CHSV iliyopunguzwa.

Kinyume na переоценено, CHSV недооценено inaonyesha watu wasiwasi sana katika wao wenyewe ambao wana shaka uwezo wao, ujuzi au kuonekana. Кама шерия, хая ни утуливу сана, утуливу, ва кавайда на васио на маони, кутокана на ukandamizaji ambao wengine wanaidhinisha CHSV яо.

Хисия я умухиму на убатили — ишара кали заиди за эго . Дайма хуваокоа вату.

Ikiwa mtu ana ego na CHSV yenye nguvu, haiwezekani kuwasiliana naye kwa muda mrefu.

Ква манено, нишати на васио вафаньякази кама вату хао ванахиси кибури ча бандия, хали я киджами, убатили на тама .

Дхана на куадибу я CSV.

Ego — насадка hii kwa umuhimu wake mwenyewe .

CHSV imefunguliwa kama hisia ya kujitegemea.

Mtu mwenye hisia kubwa ya umuhimu wake ni anayehusika sana na tendaji juu ya vitendo na maneno ya wengine. Мара ньинги wanakabiliwa на hisia ya upungufu na upungufu.

Ishara za wazi za binadamu:

Эго — Хуу ндио уонго вако, уту вако, хофу яко.

Махарадж алисема: « Или куджуа веве ни нани, унахитаджи куджуа ни нани веве си» .

Ishara za wazi za ego kubwa

1. Ego inakuweka katika eneo la faraja.
2. Haitaki wewe ujue na watu wapya. Эго дхиди я мпья нзима.
3. Ego daima ni ndogo, mara kwa mara hutamani kibali cha mtu mwingine, kutambuliwa, umaarufu.
4. Inafukuza idadi. Федха заиди, кутамбулива заиди, хешима заиди.
5. Ego anataka heshima ya mtu mwingine.
6. Inakuzuia kutambua kwamba tayari umetosha bila kuchochea nje.
7. Ikiwa huamini mtu yeyote, unaweza kufanikiwa kwa hisia zako, una hisia mbaya, hasira kabisa — hii ina maana kwamba tabia yako inataja ego.Wewe ni chini ya ushawishi wake.
8. Эго инакузуя кува вакати хуу, фикирия киту фулани. Мавазо я шида, kuchanganyikiwa katika kichwa — hii ni mkono wake. Ikiwa hakuna kitambulisho na mawazo, haitakuwa.

Jitambulishe na ego au si — дайма учагузи вако. Unaamua mwenyewe.

Unaweza kujipenda kwa kiwango cha asili, bila ego. Haupaswi kuwa na kiburi .

Нини унахитадзи куджуа вату на ква нини хавабадили

Ego yako ni upendo kwa mwili, vikwazo vyake, hofu.Хизи ни мавазо яко амбайо хаякупа амани, хисия зако, мвили вако, мазунгумзо я ндани.

Hitilafu ya mtu kuamini kila kitu ambacho mawazo yanamwambia. Anaamini mawazo yake mwambie nini, jinsi na wakati wa kufanya .

Wote kuja na kuondoka si wewe. . Мавазо яко, хисия, мвили си мы.

Ego ni utu wako, hii ni maana ya umuhimu na kiburi.

Utu — hii ndiyo iliyowekwa kwako nje ya jamii Masks yako, tabaka za kijamii, makadirio sio kweli.Ego ni ua usioonekana karibu na wewe, ambao hauruhusu mtu yeyote kuwa karibu.

Kuwa mtu binafsi — hii ni ukweli wako, ndivyo Mungu alivyofanya wakati ulipozaliwa, ni ukweli wako.

Унапочукия, его яко имеридхика.

Катика чуки, unasikia ubora wako.
Катика чуки, unajitenga mwenyewe, kati ya wengine.
Катика чуки, unakuwa na uhakika. Kuhisi kitambulisho na mtu au kitu.

Kujiamua mwenyewe — inamaanisha kujizuia.

Upendo ni kufuta kwa wengine.Upendo unahitaji kutoa dhabihu.

Ni wale tu ambao tayari kuwa mtu yeyote ana uwezo wa upendo.

Видео «Джинси вату ванавьотегемеа кибали ча мту мвингине на кутамбулива»

Ангалия видео зифуатазо. Inasema ni nini mwanadamu na cws ego.

Джинси я куцзондоа сана на куве на уфахаму

Нини ча куфаня или куондокана на CSV. :

Ikiwa unafanya kiburi, angalia wengine, basi kila kitu kitageuka.

Hakuna mtu anayehitaji kujivunia.

Sio kushangaza kusikiliza maneno yako — ni aina gani ya pup ya dunia, ambayo wewe ni baridi na jinsi unajua jinsi ya kuchana nywele zako kwa uzuri.

Ikiwa unataka kuongeza kiwango chako cha ufahamu na tazama vizuri ishara za ego, basi vitabu vifuatavyo ni muhimu:

• ОШО «Храбрость. Радость жизни Хатари» .
• Нисаргадатта Махарадж «Мими ни квамба» .

Кухусу Вату ва Кудживунья на Венье Кибури

Sijui kwa nini hutokea kwa moja kwa moja, ninahisi kuwa na wasiwasi na wavulana ambao hupimwa na mwinuko wako, kulinganisha na mimi au kuniambia: Je, umeona kile nilichofanya? Umeona kile nimefanya vizuri?

Mimi sijali kabisa wewe ni nani na nini ulichofanya huko. Unaweza kumwambia mama, labda atafurahia na kukupiga kichwa . Sihitaji kuzungumza juu yake .

Yote hii inafanana na chekechea. Tu kuchukua ndani yako mwenyewe.

: Uelewa mwenyewe, mwanga, uchunguzi wa kujitegemea — Acha gurudumu la kudumu la mateso na uelewe wewe ni nani.

: Джинси я кутафакари ква усахихи — поза, мбину, мазоэзи + видео 2.

: Кифунгу бора кухусу упендо, фураха, усава ва ндани на маэлевано.

Кудзисифу — ишара я тата дуни

Wakati wa kuwasiliana mara tu mtu anaanza kujisifu kuhusu wewe, anaanza kusubiri majibu yako.

Mtu alijisifu na anawasubiri kupenda na kuheshimiwa, kwa sababu yeye mwenyewe hapendi mwenyewe na haheshimu.

Yeye mwenyewe anajielezea kuwa mbaya, na kutoka kwa wengine inahitaji mengi . Ни рахиси квангу куондока на вату кама хао на си кутумия муда вако.

Kuangalia kwa kutafuta mwenyewe kutafuta . Kulala siofaa. Atasumbuliwa na wewe kwa kweli.

Kwa sababu umejifunza kitu kipya au kusoma vitabu kadhaa, huwezi kubadilika.Soma tu kidogo.

Хаджа я куфанья кази ква бидии. ! Lazima tutekeleze uelewa, angalia mwenyewe na ubadilishe na shauku kubwa.

Çfarë është chsv c. «ЧСВ»

Мидис нумрит тэ мадх тэ мемы нэ интернет, ка нджэ тэ пэрбашкет дхэ тепэр тэ рэндэсишме нэ кохэн тонэ — CSW, декодими и тэ цилаве штэ и нджохур пэр шумэ дхе кэртë тё тё пёртё тё. Ка тэ бэджэ ме ветэ-рэндэсинэ. Ашту си ай апо джо, шумика дэррмэс е популлсисэ (нэсе джо вендет, атэхэрэ интернети сигуришт) канэ нджэ мендим тепэр тэ лартэ пэр ветен дхэ гжикимет э тире.Pikëpamja е тире për disa gjëra është a priori më racionale, korrekte dhe jo e diskutueshme. Njerëz të Tillë kërkojnë trajtim të veçantë, edhe pse rëndësia e Tire zakonisht është e ekzagjeruar dhe është e dyshimtë. Ата тонэ пэр тэ тилла: «ЧСВ рротуллон мби!»

Dhe ata talleshin me ndihmën e aforizmave qesharake, fotografive tematike në rrjetet shoqërore. Nga vijnë personalitete të тилла? Kush doli me dikë që u bë aq i famshëm? Куш нга нжерэзит е фамшэм мунд тэ диагностикохет мне синдромин ЧСВ? Si ta kuptoni nëse keni parakushte për zhvillimin e saj? Si është e rrezikshme dhe si ta luftojmë? Lexoni të gjitha për atë më poshtë.

Rreth asaj se si mësuam për CSV

Le të fillojmë, ndoshta, me nga vjen ky term. Prezantuar nga shkencëtari i tij i njohur ezantik Castaneda. Ishte prej tij që ne së pari mësuam për një fenomen të tillë si ChSV. Dekodimi i kësaj shkurtore sot nuk shkakton vështirësi për cilindo nga përdoruesit aktive të internetit. Dhe të gjitha në sajë të gjuhës ruse wikia cyclopaedia «Lurkomore» — ajo ishte ajo që e popullarizoi meme ChSV, si dhe shumë fenomene të tjera të njohura të internetit.Për shkak të mungesës së formiteteve strikte (si në vetë «Википедия»), ky burim mbulon një numër më të madh të objekteve të ndryshme. botën moderne dhe jep një kuptim më të plotë dhe të kuptueshëm të tyre.

Kush janë ata — njerëzit me ÇSV të ekzagjeruar?

Pra, ne e kuptojmë, ChSV, dekodimi është i njohur dhe burimi që përhap njohuritë rreth tij. Por, në vetvete, nuk mund të shfaqet një ndjenjë e vetë-rëndësisë, duhet të ketë «bartësit» e saj. Дхе, сигуришт, ата джане. Нджерез тё тилл канэ кенэ гжитмонэ тэ мьяфтуешем, ветэм интернети и ндихмон ата тэ «далин нэ ботэ», нджэ нумри тэ мадх нджерезиш (пёрдоруэсит э рджетит) дхе, нимин мэ рэрпутат, нимин мэ рэрпутат, нимин мэ рретхан.Është шумэ э лехтэ пэр тэ збулуар бартэсин е ЧСВ-сэ — ветэм духет тэ пенгохени нэпэр месажет е тидж, коментет мби постимет диса херэ, дхе чдо гджэ до тэ бэхет менджехерэ э qartë. Тэ гжитха биседат э тидж жвиллохен ме нджэ кэллим криесор — пер тэ тёргур вэменджен, пер тэ декларуар публикун пэр фтохтэсинэ дхе униситетин э тире, дхе нджэкохэ цёр эш-эшт пкёр.

Ka shumë njerëz të njohur të medias mes njerëzve që kanë mbivlerësuar dhe të patundur. Për shembull, shpesh në rrjetet sociale, kjo karakteristikë u aplikua tek projektuesi dhe blogeri rus Artemy Lebedev, një televizor dhe radio-pritës, si dhe një bloger skandaloz për rrjetet sociale, bloger dhe rrjetet sociale.Të gjithë ата janë të njohur për antics e Tire të egër, qëndrim egoist dhe shprehje shprehëse në punë / punë. Ka gjithmonë disa mosmarrëveshje, zhurma, diskutime dhe emocione (shpesh negative) rreth tyre, megjithatë, në shumicën e rasteve kjo përfshihet në planet e tyre.

ChSV në jetën reale

Përsa i përket të famshëmve dhe figurave popullore në media, gjithçka duket të jetë mjaft logjike — ata kanë nevojë për PR, ata duhet të bisedojnë. По për njerëzit e zakonshëm, jo ​​publikë si ti dhe unë? A keni paguar ndonjëherë vëmendjen ndaj sjelljes suaj dhe se si poziciononi veten kur komunikoni me njerëzit e tjerë (madje edhe në internet, së paku jeta reale)? Në Fund të Fundit, QPS-ja e tepërt mund të ndërhyjë shumë, shumë.

farë është e mbivlerësuar CHSV mund të jetë e rrezikshme?

Së pari, mund të ndikojë negativisht në komunikimin me njerëzit e tjerë: miqtë, familjen, kolegët dhe vetëm ata që na rrethojnë çdo ditë. Сы ндикон ЧСВ-я жуай нэ? Dekodimi i këtij koncepti mund të tingëllojë kështu: «Унэ джам кёртхиза и токес». Kush do të donte këtë pozitë? Нук ка гджаса që колегу джуадж, дхе мадже эдхе ме шумэ шефи, до тэ джете и люмтур тэ пуноджэ ме нджэ нджери пер тэ чилин интересат е тидж джанэ мби тэ гджита.Dhe njerëzit vendas? A është e lehtë që ata të bashkohen me ju dhe të përpiqen të kënaqin të gjitha tekat? Herët ose vonë, ai që komunikon me transportuesin e ChSV, durimi do të përfundojë dhe lidhja do të plasë.

Së dyti, një CHSV и ekzagjeruar ju dëmton më së shumti. Pozicioni «Унэ джем мэ и мири / пэрсосур / гджитнджэ и дрейтэ» мунд тэ шоджэ лехтэ нэ деградим, нэ мангесэ тэ ветэ-жвиллимит, шурдхим дхе вербэри ндадж мендимеве тхе дэш. Si rezultat, ju mund të tërhiqeni në veten tuaj dhe të humbni kontaktin me realitetin.Sigurisht, kjo është në raste të rënda, por gjithçka fillon e vogël.

Si të mos bini në kurthin e ChSV?

Nëse vëreni një sjellje të tillë, mendime, deklarata, atëherë ia vlen të ndaleni dhe të mendoni: «Пс джам герцог вепруар кешту дхе шфарэ мунд тэ бэхет?» Natyrisht, në vetvete, ChSV duhet të jetë prezent në çdo person, por në një proporcion të arsyeshëm. Си тё rrezikshme dhe të dëmshme si mbiçmulus. Mundohuni të gjeni një ekuilibër. Мбаджени пикёпамджет дхе мнит туаджа, нэсе ато джанэ тэ базуара, дискутуара дхе пешохен, пор респектогнэ мендимет и кундэрта дхе тэ ндрышме.Джини тё vërtetë për veten, por dëgjoni të tjerët — kjo është e dobishme. Са и пёркет рджетеве социале, нганджехерэ штэ мэ мирэ тэ «калош» диса постэ сеша тэ футеш нэ биседа бошэ, штэ мэ мирэ тэ беш дичка мэ тэ добишме дхе производительный. Fat i mirë!

Rrjetet sociale kanë Futur Shumë terma në gjuhën, një prej tyre ishte ChSV. Është e vështirë të gjesh se çfarë do të thotë kjo dhe ku zbatohet nëse një person nuk di për dekodimin dhe nuk ka njeri që t’i tregojë. Интернет жаргон пёрдор шкуртимин ČSV vetëm për të treguar një rëndësi të madhe të prekur të një kundërshtari.

farë do të thotë ÇSV dhe si është deshifruar

Për herë të parë kombinimi i ChSV u shfaq në internet rusisht-folës midis admiruesve të Carlos Castaneda — спанике дэзоти-эзоти. Ай përshkroi në libra një ngritje мораль mbi një человек tjetër në fjalë, jo në vepra. Interesuar në shkurtimin ChSV — çfarë do të thotë shkurtesa? Кето три шкронджа збулохен си «нджэ ндженджэ э ветэ-рэндесисэ». Përndryshe, QPS mund të quhet vlerësim i vetvetes, që është vështirë të heqësh dorë.

Пёр шкак тэ фактит сэ нджэ человек влэрэсон важдимишт рёндэсинэ дхе динджитетин э тидж, мерр шумэ кохэ, пенгон нджэ вештрим тэ матур нэ ситуатэ дхе мерр нджэ вендим. Sipas librave ezoterikë, një ndjenjë e vetë-rëndësisë është негативный, është e nevojshme të heqësh qafe, sepse përfshin shumë energji, duke lënë vetëm forcën shumë energji, duke lënë vetëm forcën шёнд керроресе

ChSV tepricë në rrjetet sociale

Shpesh përdorimi i fraksionit СCV gjendet në rrjetet sociale, ku mund të fshihesh pas një fotoje të një avatar dhe të rjetet sociale.Analogjia е shkurtesës janë termat arrogancë, arrogancë dhe krenari. Njerëzit me një ndjenjë të vetë-rëndësisë vazhdimisht i prezantojnë meritat e Tire të tjerëve. Mospërfillja е Меритаве тэ тиир трегон гджиташту нджэ ndjenjë тэ ekzagjeruar të vetë-rëndësisë.

Një tjetër mundësi ku mund të takoni termin — lojërat online. Atje zbatohet ndryshe — në lloje të ndryshme të lojërave, por shpesh përmendet në të ngjashmet rrjeteve sociale konteksti. Një lojtar me megalomania, mbivlerësimi i tij dhe aftësitë e tij, arroganca dhe narcizmi, meriton «shpërblimin» e këtij përshkrimi.Характеристики онлайн-шкон нэ джетэ, герцог у шфакур си левдатэ дхэ амбици. Хекджа э садж ште э вэштирэ.

farë do të thotë CSV VKontakte

Jo të gjithë njerëzit e dinë se çfarë është CSV në VK. Ju mund të mësoni për këtë ndjenjë, të veçantë për një person, nga manifestastimet e mëposhtme:

• një person është krenar për veten, e konsideron veten të rëndëve fjëer njëm мнение,
• kotësia, ambicia, ndjenja e tepruar e dinjitetit;
• një человек nuk është në gjendje të dëgjojë kritikat;
• нук мунд тэ куптойнэ ньерезит нормалишт, тэ флэсин ме тэ штэ э вештирэ;
• kërkon respektim maksimal për veten, madje edhe në mungesë të rasteve reale;
• аи важдимишт тёрхек вэменджен нэ ллогаринэ э тидж — ай мбан коменте пэр ветен, я пэлкен шэнимет э тидж, шкруан шумэ артикуй, е лэ спойлерин нэ ришикимератэ тэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэджэпэктэратэ, па респ.

Куш ште и тилль DotA?

Nëse ju pëlqen loja konkurruese Dota 2, atëherë nuk do të dëmtonte të dip më mirë: CHSV — çfarë do të thotë kur komunikon me përdoruesit e tjerë? Të gjithë lojtarët arrijnë nivele të ndryshme aftësie, të cilat mund të shkaktojnë konflikte në chat mes të mirëve dhe atyre që përballen më keq. Shumica e fituesve mburren me një nivel të pabesueshëm të mjeshtërisë, dhe ata mund të fajësohen për të tepërt.

Një ndjenjë e vetë-rëndësisë nënkupton që një person në masë të madhe ekzagjeron dhe lartëson rëndësinë ose aftësitë e tij, герцог у treguar të tjerëteve rreth talen.Lojtari ka një agresion në ndonjë fjalë apo veprime, sepse në fakt brenda tij e konsideron veten inferiore. Një человек мне një ndjenjë mbivlerësimi të rëndësisë në DotA është tepër и varur nga thinket e të tjerëve, и jep атидж шумэ vëmendje dhe prandaj është e kotë.

Çfarë është një moshë e errët?

Një tjetër lojë popullore — Темный век — në pjesën e pyetjeve popullore përgjigjet rreth QPS-së — çfarë do të thotë ky term. Ajo qëndron për numrin e gjërave.Çdo lojtar ка lojëra elektronike — gjëra që rrisin rëndësinë në lojë dhe nivelin e mbrojtjes. Kategoritë e rëndësishme përfshijnë gjërat vetë, mprehje, драгоценные камни. Са мэ шумэ лоджера тё тилла нэ лоджтар, ак мэ и лартэ ёште форса э тидж. Ju mund të mësoni më shumë për këto terma direkt në faqet e MMORPG Age Dark Age.

Numri i gjërave që Fuqia shprehet në mënyrë sasiore, герцог arritur shumën e të gjitha sendeve në dispozicion. Вешдже, гурэ, афтэси, сэнде кафшет дхе куаджт канэ мунд тэ ндикоджнэ нэ кэтэ.Numri i Paratrave të fuqisë së gjërave varet drejtpërdrejt nga numri i amuleteve të fituara ose të marra, sendet magjike. Джу мунд тэ ррисни нивелин е тире герцог мпрехур, герцог удждисур ме гурэ дхе гурэ, герцог у римекембур.

Видео: rreziku i vetë-rëndësisë

Vetë-rëndësia dhe kotësia janë shenjat më të spikatura të egos . Ата gjithmonë и shtyjnë njerëzit larg.

Нэсе нджэ личность ка нджэ эго дхэ чсв шумэ тэ жвиллуар, штэ э памундур тэ комуникош ме тэ пэр нджэ кохэ тэ гджатэ.

Me fjalë, energjia dhe jo-verbalica njerëz të tillë ndjehen arrogancë e rreme, kushtëzim social, kotësi dhe ambicie .

Концепция интерпретации в CSV

Эго është lidhja me vetë-rëndësinë. .

ChSV qëndron për Self Esteem.

Një person me një ndjenjë të ekzagjeruar të vetë-rëndësisë është shumë e prekshme dhe reaguese ndaj veprimeve dhe fjalëve të të tjerëve. Shpesh ndjen një ndjenjë të inferioritetit dhe inferioritetit.

Shenjat e dukshme të një ChSV të personit të mbivlerësuar:

эго — kjo është vetja juaj e rreme, personaliteti juaj, frika juaj.

Maharaj tha, « Për të gjetur se kush jeni, duhet të dini se kush nuk jeni». .

Шенджат э карта тэ нджэ эго тэ мадхе

1. Ego ju mban në zonën e rehati.
2. Нук дэширон кэ тэ такош ньерез тэ риндж. Эго кундэр тэ гджитха тэ реджа.
3. Egoja është gjithmonë е vogël, është vazhdimisht dëshirë për miratimin, njohjen, famën e dikujt tjetër.
4. Po ndjek numrat. Мэ шумэ пара, мэ шумэ ндже, мэ шумэ ндериме.
5. Ego kërkon respektin e dikujt tjetër.
6. Kjo ju pengon të kuptoni se tashmë jeni të vetë-mjaftueshëm па стимулы të jashtme.
7. Нэсе нук и бесони аскуджт, джепни лехтэсишт эмосионет туаджа, кени нджэ юмор тэ кек, джени тэ земёруар — кжо до тэ тхотэ кэ эгоджа диктон сьелльджен туадж. Ju jeni nën ndikimin e tij.
8. Ego ju pengon të jeni në момент, герцог у përqëndruar në një gjë.Mendime të hutuara, konfuzion në kokë — kjo është veprimi i tij. Нэсе нук ка идентифицируй меня мендиме, кжо нук до тэ ндодхэ.

Пэр ту идентифицировать меня эгон апо джо është gjithmonë zgjedhja juaj. Ju vendosni për veten tuaj.

Ju mund ta doni veten në nivelin më të natyrshëm, pa ego. Nuk duhet të jeni arrogantë .

farë duhet të dinë njerëzit dhe pse nuk ndryshojnë

Epoja juaj është lidhja me trupin, kufizimet e tij, frika. Këto janë mendimet tuaja që nuk ju japin paqe, emocionet tuaja, trupin tuaj, dialogun e brendshëm.

Gabimi i njeriut është të besosh gjithçka që mendimet i tregojnë atij. Ai beson se mendimet e tij tregoni se çfarë, si dhe kur të bëni .

Çdo gjë që vjen dhe shkon nuk është ju . Mendimet, emocionet, trupi juaj nuk jeni ju.

Эго është personaliteti juaj, ky ndjenjë e vetë-rëndësisë dhe krenarisë.

Personaliteti është ajo që ju imponohet nga jashtë shoqërisë. , maskat tuaja, mbivendosjet sociale, parashikimet nuk janë vetja juaj e vërtetë.Эго është gardhi и padukshëm përreth jush që nuk e mbajnë askush të afërt.

Bëhuni një индивид — kjo është e vërteta juaj, kështu ju bëri Perëndia kur u lindët, ky është realiteti juaj.

Кур джу уррени, ветджа джуадж është e kënaqur.

Në urrejtje ju ndjeheni më superior.
Në urrejtje ju e vendosni veten larg të tjerëve.
Në urrejtje bëhesh i sigurt. Дикуш ндихет, я идентифицирую меня, дикё апо дичка.

Për të përcaktuar veten është të kufizosh veten.

Dashuria po shpërndahet në të tjerët. Dashuria kërkon sakrifikimin e egos.

Vetëm ата që janë gati të bëhen të gjithë mund të duan.

Видео «Si njerëzit janë të varur nga miratimi dhe njohja e dikujt tjetër»

Shikoni videon tjetër. Ajo thotë se çfarë është egoja e njeriut dhe chsv.

Si të shpëtojmë nga tepërt dhe të bëheni të vetëdijshëm

farë duhet të bëni për të hequr qafe :

Nëse silleni me arrogancë, shikoni poshtë tek të tjerët, atëherë të gjithë do të largohen.

Аскуш нук ка nevojë për mburrjen tuaj.

Аскуш нук është и интересуар të dëgjojë fjalët tuaja — çfarë është kërthiza e tokës, sa e freskët jeni dhe si mund të krehni bukur flokët tuaj.

Nëse doni ta rrisni nivelin e vetëdijes dhe të njoftoni më mirë shenjat e egos në vetvete, librat në vijim janë të dobishme:

• Ошо «Кураджо. Газими и жетес герцог Ррезикуар .
• Нисаргадатта Махарадж «Unë jam që» .

Пер ньерезит мбурравецэ дхэ высокомерие

Unë nuk e di pse, kjo ndodh automatikisht, unë pështiem me djemtë që matin pjerrësinë e Tire, krahasojnë veten me mua ose më thonë: А кени пара атё që bëra? A e shihni se sa i mirë jam?

Unë absolutisht nuk e di kush jeni dhe çfarë keni bërë atje. Mund t’i thuash mamit, ndoshta ajo do të vlerësojë dhe do të të fusë në kokë. . Nuk kam nevojë të flas për këtë. .

Gjithçka na kujton kopsht fëmijësh.Vetëm largoje prej teje.

: vetëdijesimi, ndriçimi, vetë-hetimi — dilni nga rruga e pafund e vuajtjes dhe kuptoni se kush jeni.

: si të meditoni saktë — sjellje, teknikë, praktikë + 2 видео.

: артикулл и букур пер дашуринэ, люмтуринэ, балансен дхе гармонина и бреншме.

Хвастовство është një shenjë e kompleksit të inferioritetit

Кур комуникон, сапо нджэ человек филлон тэ мбуррет мне ти, ай филлон тэ пресэ пэр реагимин туадж.

Njeriu krenohet dhe pret që të admirohet dhe respektohet, sepse nuk e do veten dhe nuk respekton.

Ai e trajton veten keq dhe kërkon shumë nga të tjerët. . Është më e lehtë për mua të largohem nga njerëz të tillë dhe të mos harxhoj kohën time.

Kërkuesi do ta gjejë veten duke kërkuar . Fjetja nuk vlen të zgjohesh. Ай до тэ офендоджэ пэр ты пэр тэ вэртетэн.

Për shkak se keni mësuar diçka të re ose lexoni disa libra, nuk do të ndryshoni.Nuk mjafton për të lexuar.

Duhet të punosh shumë për veten ! Është e domosdoshme të prezentosh ndërgjegjësimin, të shikosh veten dhe të ndryshosh veten me pasion të madh.

A e konsideroni veten një person të rëndësishëm, aq të rëndësishëm sa që askush nuk mund të përballojë pa ndihmën tuaj? Si rregull, njerëzit me ÇSV të ekzagjeruar mendojnë kështu. Ндошта кджо до тэ дукет кешараке пэр та, пор шеллджа е тилль штэ диси э дхимбшме, прандадж, штэ тйешт е невойшме пэр ата që перпикен пэр пэрсосмёри тё куптжнэ.

Si do të thotë ЧСВ?

Мэ шумэ гьяса, ю кени парэ нэ мэнырэ тэ пэрсэритур нэ интернет нджэ шкуртим тэ нгджашэм, и чили ндодхей нэ афэрси тэ физиономисэ сэ нджэ персони тэ пакёнакур осэ qenieje. Çfarë do të thotë kjo nga ChSV është një pyetje mjaft e arsyeshme për ata që me të vërtetë duan të dinë se çfarë qëndron pas këtyre tre letrave. Нджэ ндженджэ э ветэ-рэндэсиэ — кэшту дукет шкуртими и кëтидж шкуртими. Диса экспертэ э плотэсойнэ атэ мне нджэ фьялэ тэ тиллэ си котэси.

Një person me një ChSV të fryrë është shumë i ndjeshëm dhe reags ndaj veprimeve dhe fjalëve të kritikëve që dëgjohen në drejtimin e tij nga të tjerët. Njerëz të tillë shpesh përjetojnë ndjenja të inferioritetit, inferioritetit dhe vetëkritikës. Ата джанэ натирэ э nxehtë дхе агресив э натиршме. Дхе тё гджитха, сепсе ата и консидеройнэ ветен диси ндрышенга тэ гджитэ тэ тджерэт.

Vetë-Rëndësia — Psikologji

Шумэ нджез кэ, нэ нджэ шкалл апо нэ нджэ тджетер, канэ нджэ типар тэ тилль темперамент, нук джанэ нэ гджендже тэ влэрэсойнэ нэ мёйрэ адекуате гдженджен е тире псикологйике.Ата джанэ плотэсишт тэ биндур се мэныра э тире е джетесэс штэ мэ э сакте, кешту кэ ата нук дэгджоджнэ кешиллат е тэ хуаджве, герцог перфшире эдхе тэ афэрмит э тире. Rritja e ÇSV karakterizon një личность си një личность эгоист, пара тё чилит тё гджита корнизат дхе куфиджте духет домосдошмёришт тэ збулохен.

ChSV në gratë ndodh shumë më shpesh sesa në seksin më të fortë. Dhe ky është shpjegim mjaft и kuptueshëm. Një grua është një nënë dhe një grua që, sipas mendimit të shumë njerëzve, duhet të mbajë gjithçka nën kontroll.Пер кëте арси, шумика э амвише бесойнэ се нэсе нук э бэджнэ кэтэ апо атэ пунэ штэпйаке, э гжитэ бота до тэ ндалет. Пёрвеш кёсадж, шумэ гра джанэ мэсуар тэ бесоджнэ се тэ гджитха вепримет э тэ афрмве дхе тэ микве ррет садж нук джанэ тэ сакта, кешту që ата по пэрпикен тэ вёнш кджанеша тэджет пэрпикен тэ вёнш кджершилла паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет паджет пэджтэ

ЧСВ — а ште э мирэ апо э кеке?

Cila është CSV, ne kemi zbuluar tashmë. Тани духет та куптоджме се чили штэ роли и ксай цилэси тэ темперамент нэ джетэн э нджэ персони.Шумэ prej nesh besojnë se një ndjenjë e vetëvlerësimit është sinonim. Megjithatë, kjo është një ide e gabuar. Кур ndihet një ndjenjë e dinjitetit, kjo do të thotë që një человек qëllimisht dëshiron të qortojë me qëllim që të ofendojë. Ndërsa në rastin e SV, kjo është një çështje kritike, që lidhet exkluzivisht me narcisizmin njerëzor dhe krenarinë, e cila nuk është konsideruar asnjëherë.

Герцог humbur një ndjenjë të vetë-rëndësisë, ne bëhemi të paprekshëm, sepse nuk ka reaksion emocional ndaj fjalëve apo veprave.Мунгеса е ЧСВ и Джеп нджэ бэсим персонит ветес, сепсе кур на курсени нга имажет е ларгета, нук кеми мэ асгджэ пер тэ хумбур. Базуар нэ са мэ sipër, bëhet e qartë se një ChSV e mbivlerësuar nuk është një типар и мирэ я темперамент.

Синдроми и ЧСВ

Ndjekja е zhvillimit të kësaj cilësie të karakterit është jashtëzakonisht e vështirë. Specialistët e kualifikuar karakterizojnë një ChSV të mbivlerësuar në манифестимин е «sindromës së shkëlqyer të studentëve», дометенэ një персона и cili është përdorur për ask të llojitur mee.Njerëz të tillë, si rregull, kanë arrogancë të tepruar, хамство dhe në të njëjtën kohë disa shkëputje, e cila shpjegohet shumë thjesht: për mungesën e një në Tillë thjesht: për mungesën e një në Tille njerçë dér gëzojnë egocentrizën e Tire dhe superioritetin ndaj të tjerëve.

Шенджат э ЧСВ

Përcaktimi nëse një человек ка një ndjenjë të vetë-rëndësisë apo jo nuk është aq e lehtë. Shkencëtarët kanë nxjerrë teorinë e Tire, sipas të cilës njerëzit me ÇSV sillen sipas skenarit të mëposhtëm:

1. Sindromi i mentorimit .Ky është rasti kur një человек përpiqet të imponojë pikëpamjen dhe pikëpamjen e tij për të gjithë.
2. контейнер . Përleshjet e shpeshta me partnerët dhe thjesht me miqtë, gjatë së cilës një индивид и cili ka një ÇSV të ekzagjeruar, përpiqet të provojë pikëpamjen e tij, dukej dhj.
3. justifikim . Ngritja е vetëbesimit герцог ekspozuar veten në anën më të mirë, ndoshta të pavërtetë.
4. Tërheqja e vëmendjes së të tjerëve .Një mënyrë tjetër për të rritur vetëvlerësimin e Tire, dëshirën për të qenë në qendër të të gjitha ngjarjeve. Çfarë ndodh nëse diçka ndodh pa pjesëmarrjen e tij — do të jetë rënia e gjithë университ.
5. Ndjenja e fortë e hakmarrjes . Нэ кэтэ раст, персони филлон тэ меррет меня критикат э шпрехура нэ дрейтимин и тидж. Эдхэ нэсе аджо штэ акузуар нэ раст, дэними, кофте словесное апо физик, нук до тэ шмангет.
6. Pasioni për disavantazhet e njerëzve të tjerë .Кыште ндошта шембулли мэ и мрекуллуешем и манифестимит тэ ЧСВ. Në sfondin e gabimeve të njerëzve të tjerë, këta njerëz po përpiqen të ngjiten në hapin më të lartë të piedestalës dhe të tregojnë se janë më të papërlyer.

Një ndjenjë e vetë-rëndësisë — si të shpëtojmë?

Përkufizimi i asaj që ChSV nuk është e mjaftueshme për të hequr qafe këtë tipar jo shumë të mirë të karakterit. Duhet të dini se si të merreni me këtë проблема. Kur CSV rrotullon, duhet të marrësh masa për ta përjashtuar atë.Epo, nëse mund ta vini re këtë mungesë në vetvete. Шумэ мэ кек нэсе е абсолютишт и сигурт се ке тэ дрейте. Në këtë rast, është më mirë t’i kushtohet vëmendje këshillës së njerëzve më të afërt. Ата ме сигури нук до тэ кэшиллоджнэ тэ кёкиджат. Пра, герцог tërhequr një paralele midis sjelljes suaj dhe shenjave të mësipërme, mund të përcaktoni lehtësisht nëse keni një ChSV të ekzagjeruar apo jo.

Si të ulësh ЧСВ?

Heqja е kësaj cilësie është hapi kryesor drejt një jete të plotë, ку нук ка эгоизэм дхе критика.Нивели и ЧСВ мунд тэ редуктохет лехтэсишт:

• shkruani, pa ekzagjerim, aspektet pozitive dhe отрицательный të karakterit tuaj;
• mendoni për këtë, por nëse jeni të ndërgjegjshëm, ju udhëheqni një jetë;
• шкруани эмрат е атыре që ishin lënduar dhe ofenduar nga një fjalë e keqe;
• përpiquni të adoptoni një botëkuptim të ri;
• formojnë një qëndrim të ri ndaj vetes dhe të tjerëve;
• бени нджэ баст ме ветен се до тэ ндрышони сы шпейти (кджо практике штэ мэ е эфектшме).

Си тё рритет ЧСВ?

Shpesh mund të hasni njerëz të tillë që kanë një ndjenjë të rëndësisë së tyre plotësisht të munguar. Do të duket se kjo duhet të gëzohet, sepse nuk ka krenari, as kotësi, as egocentrizëm. Megjithatë, jo gjithçka është kaq e thjeshtë. Нджэ ЧСВ и нэнвлерэсуар мунд тэ сьеллэ нджэ проблема тек нджэ человек джо мэ пак се нджэ мбипопуллим и кëтидж типари тэ карактерит, прандадж штэ э невойшме тэ нджихен текникат кэ до тдженджен-эндихмо.

Në mesin e mijëra memes aktuale në internet, ju ndoshta keni qindra herë u takua shaka rreth CSW mbivlerësuar. Kjo shprehje zhargoni përdoret më shpesh në mesin e të rinjve.

Sot, do të mësosh se çfarë do të thotë për një person në CSV! Ne do të flasim për të deshifruar fjalën dhe detaje të tjera interesante në lidhje me këtë мем.

Si të dekriptohemi

Le të fillojmë me më interesantin — мне декодим.

ЧСВ — нджэ ndjenjë e vetë-rëndësisë .Нга рруга, диса пёрдоруес е дешбимин атэ си нджэ ндженджэ тэ мадхештисэ си тиир, е чила гджиташту мунд тэ консидерохет опциони и духур. Пер фат тэ кек, нэ кохен тонэ, кжо сэмундже ндодх нэ шумэ, дхе вечанёришт — тек тэ ринджтэ.

Adoleshenti, i cili po largohet nga ChSV, kërkon një marrëdhënie të veçantë. Ai sinqerisht e konsideron veten më mé mirë se të tjerët, është i pajisur me vetëbesim dhe ka mendimin e tij për gjithçka.

Por në fakt, rëndësia e këtyre të rinjve është shumë e ekzagjeruar.Nga rruga, në qoftë se dikush le një shaka në lidhje me faktin që ju keni një CHSV ekzagjeruara, ju duhet të dini — kjo nuk është një kompliment në të gjitha!

На дукет се нджезит цэ важимишт збавитен ветен меня нджэ ндженджэ тэ рендесисэ сэ тии мунд тэ квэн эгоистэ!

Si është përkthyer ЧСВ

Është thjesht zhargon, i cili rrjedh nga tkurrja e fjalëve Vetë-rëndësi dhe nuk mund të përkthehet. Me fjalë të tjera, kjo është vetëm një shkurtim, që do të thotë absolutisht asgjë në anglisht.

Подростковая ЧСВ

ЧСВ është përdorur shpesh në zhargon e të rinjve dhe nuk është vetëm kjo. Моша е tranzicionit лидхет drejtpërdrejt ме shfaqjen е ndjenjave të tepërta (madje edhe të dhimbshme) të vetë-rëndësisë.

Vetëm se të rinjtë kanë nevojë për miratimin e të tjerëve, ata duhet të fitojnë respektin e kolegëve të утомляет меня çdo kusht. Është kaq e etur për të qenë popullor dhe në kërkesë. Джемте е ЧСВ по фитойнэ врулл, пор, фаткэксишт, результат и жгэнджен шумэ.

Një adoleshent me një ndjenjë frymore të vetë-rëndësisë duket e kotë dhe e vetëqëndruar. Dhe kjo, si rregull, i largon të tjerët prej tij.

Edhe ndaj miqve dhe prindërve të një fëmije bëhet e vështirë të durohet një gjendje e tillë, prandaj konfliktet dhe grindjet janë duke filluar. Marrëdhëniet çahen dhe adoleshenti fillon të vuajë.

Në shikim të parë, ChSV është vetëm një meme zbavitës dhe shaka kaustike që lidhen me të. Por nëse gërmon më thellë, bëhet e qartë se kjo është një tipar shumë negativ i karakterit, nga i cili duhet të heqësh qafe sa më parë.

фрира CDA

Është shumë e lehtë për të përcaktuar njerëzit me ÇSV të mbivlerësuar! Мьяфтон тэ шохим мёнырен и тире тэ комуникимит, сьелльен ме миктэ дхэ тэ афэрмит дхе сэ паку нджэ херэ пэр тэ парэ нджэ человек нэ ндже атмосферэ тэ пакэндшме пер тэ. Çdo gjë menjëherë bëhet e qartë.

Nga rruga, në internet ju gjithashtu do të njoftoni me lehtësi njerëzit me ChSV fryrë. Куштодзини ваммендже коментеве тё тире дхе стиль тэ шкримит. Njerëz të Tillë дуан të mësojnë të gjithë rreth mendjes dhe në çdo mënyrë të mundshme për të tërhequr vëmendjen ndaj vetes.Ата дуан тэ tregojnë unitetin е тире дхе «фтохтэсинэ» ​​për të gjithë botën.

Kjo nuk është fare e ftohtë.

Dëshironi të mësoni më shumë rreth QPS-së? Shikoni një video të shkurtër для информации:

Dhe nëse mendoni shumë për veten, atëherë kjo është një arsye për të menduar. Dhe nëse ChSV juaj nuk ka shkuar përtej arsyes?

როგორ ამოიღონ შეტყობინებები VK- ში უფასოდ. რა არის ВК პრეპარატი? Лс вконтакте

ოცნებობთ პოპულარობაზე სოციალურ ქსელში? ან იქნებ გსურთ თქვენი შურიანი ხალხის გაღიზიანება? ВКонтакте- ს პოპულარობა ძალიან მარტივია: რაც უფრო მეტ ადამიანს აინტერესებს თქვენი ცხოვრება, მით უფრო მაღალია ეს ზოლი.ამ მიზნით, ანგარიშის მფლობელები ხშირად მიმართავენ პირადი შეტყობინებების მოხვევას Vk- ზე.

Ჰო მართლა! ВКонтакте შეტყობინებების მოტყუების ყველა სერვისი უკვე გაერთიანებულია ერთ დიდ რეიტინგში.!

რა აზრი აქვს მოტყუებას?

შეტყობინებების ხელოვნური მოტყუება გამოიყენება VK- ზე «პოპულარობის ილუზიის» შესაქმნელად და სოციალური უსაფრთხოების რისკის გასაზრდელად. და ეს ნამდვილად არის ილუზია და არა რეალობა. ათობით, ასობით და კიდევ ათასობით ყალბი დიალოგი არ გახდის უფრო საინტერესო, ლამაზი და ჭკვიანი რეალურ სამყაროში.თქვენ ალბათ უკვე შენიშნეთ აბრევიატურა «ЧСВ». გსურთ იცოდეთ რას ნიშნავს ეს? ჩვენ სიამოვნებით ავუხსნით! ЧСВ ნიშნავს «საკუთარი მნიშვნელობას» და ეს არ არის ადამიანის საუკეთესო ხარისხი.

მოტივები:

• ВКонтакте სოციალური ქსელის ზოგიერთი მომხმარებელი მიმართავს. პოპულარული ანგარიშების გაყიდვა დიდი შესაძლებლობაა დამატებითი ფულის შოვნისა დიდი ძალისხმევის გარეშე. და რომ გვერდზე გაიყიდოს სხვა მომხმარებელი, ეს უნდა გახდეს «აქტიური». ამ ტიპის შემოსავალი შეიძლება უცნაური და უჩვეულო ჩანდეს, მაგრამ მოთხოვნა ქმნის მიწოდებას.
• დიდი რაოდენობა და შემომავალი შეტყობინებები არის მთავარი მიზანი მომხმარებლებისთვის, რომელთაც სურთ აღიარონ და შემდეგ — ВКонтакте გვერდის გადამოწმება. ეს სიტყვა შეიძლება უცნობად ჟღერდეს, მაგრამ, სავარაუდოდ, ჩვენ ყველამ შევნიშნეთ ცნობილი ადამიანების ანგარიშებში «ცისფერი ჩეკის» არსებობა. ეს არის გადამოწმება — დადასტურება, რომ გვერდი არ არის ყალბი. ბევრი ნადირობს ამ «ტკიპზე».
• სხვა მომხმარებლები იყენებენ ნარკოტიკებს ახალი ნაცნობებისთვის. ბოლოს და ბოლოს, თქვენ არასდროს იცით ვინ ზუსტად მოგწერს.უნიკალური შესაძლებლობაა საინტერესო ურთიერთობებთან აუცილებელი კავშირები ან მეგობრობა.
• ადამიანების უფრო მცირე კატეგორია თაღლითობს სუფთა ცნობისმოყვარეობის გამო. ეს არის ერთგვარი სათამაშო თამაში, როდესაც «დიალოგების» ჩანართზე რიცხვები სწრაფად იზრდება და სულს ასიამოვნებს.

დაწინაურებული Vk ანგარიშები სწრაფად გაიყიდება. მყიდველებს შეუძლიათ გამოიყენონ ახალი გვერდი სხვადასხვა მიზნებისთვის, მაგრამ მათ ყველას სურთ ერთი რამ — იპოვონ «ცოცხალი» ანგარიში ყოველგვარი მარკირების გარეშე.გამოცდილმა მომხმარებელმა იცის როგორ ამოიცნოს ხელოვნური მოწონებები, განმეორებით განთავსება და ა.შ. მაგრამ პირადი შეტყობინებებით ყველაფერი განსხვავებულია. როგორ უნდა გავიგოთ, რომ ინტერესი ყალბია, თუ ნარკოტიკებს ნამდვილი მომხმარებლები წერენ? ამისათვის გამოიგონეს ასეთი ჭკვიანური ხრიკი.

თანამედროვე ბიზნესი დიდი ხანია დამოკიდებულია სოციალურ სერვისებზე. ქსელები. მეწარმეები ცდილობენ მაქსიმალურად გამოწერონ პოპულარული სერვისი (მაგალითად, ისინი ქმნიან ცალკეულ ანგარიშებს, რომლებზეც წარმოადგენენ თავიანთ საქონელს და მომსახურებას).ამ შემთხვევაში, თაღლითური შეტყობინებები ასევე ეფექტურია. ადამიანი გამოჩნდება ინტერნეტით, იწყებს დიალოგს და შემდეგ სწავლობს თქვენს გვერდს. და თუ ის პროდუქტით მინიმალურად არის დაინტერესებული, მაშინ ის ავტომატურად ხვდება პოტენციური მყიდველების კატეგორიაში. შემდგომი — ტექნოლოგიური საკითხია!

როგორ ამოიღონ ВК შეტყობინებები უფასოდ

გეგმის განსახორციელებლად შეგიძლიათ გამოიყენოთ სამი პოპულარული მეთოდი, რომელთა გამოყენება უნდა გამოიყენოთ თქვენივე საფრთხის ქვეშ და რისკის ფასად:

1. მოატყუეთ პირადი შეტყობინებები სპეციალური VK ბოტების გამოყენებით:
2. თვითრეკლამა (მრავალი PR საზოგადოების დახმარებით ВКонтакте-).სოციალურ ქსელში უამრავი ჯგუფია, რომლებიც მომხმარებლებს საშუალებას აძლევს ურთიერთგაცვლა გაითვალისწინონ ამა თუ იმ საქმიანობაში. «Помет LS», «Like-Time», «В друзья» და მრავალი სხვა. პირადი შეტყობინებების შემოდინებისთვის საკმარისია კომენტარის დატოვება ჯგუფის კედელზე კონკრეტული მოთხოვნით;
3. მოატყუეთ მომსახურების საშუალებით (მაგალითად). ამ ბოლო დროს ბევრი გაცვლა გამოჩნდა სოციალური დავალებებით. ქსელები. ბავშვიც კი გაიგებს სერვისზე მუშაობის არსს: მოიწონეთ / გამოაგზავნეთ / პირადი შეტყობინება თქვენი მხრიდან = პასუხი სხვა მომხმარებლისგან.

მოატყუეთ შეტყობინებები (смс) VK საიტზე — ინსტრუქციები

როგორ დაასრულოს ВКонтакте შეტყობინებები საკუთარ თავს და სწრაფად? ჩვენ გთავაზობთ, რომ წაიკითხოთ დეტალური ინსტრუქციები ეკრანის ანაბეჭდებიდან ჩვენი სერვისიდან.

1. თქვენს პირად ანგარიშში უნდა შექმნათ «უფასო» დავალება.

2. გვერდის ბოლოში აირჩიეთ «სხვა» განყოფილება

3. აღწერეთ კონტრაქტორთან ურთიერთობის დეტალები და პირობები.

ვის არ სურს ათეულობით წაუკითხავი წერილის ნახვა საკუთარ პირად ანგარიშზე ?! ისევ აკრეფით მომხმარებლის სახელი და პაროლი ჩვენს ტაბლეტზე ან ლეპტოპზე, ჩვენ ყოველთვის ვიმედოვნებთ, რომ მინიმუმ ცუდი ნიშანი დავათვალიეროთ „ჩემი შეტყობინებები“ ჩანართთან და ისე, რომ ადამიანი არ საუბრობს, მაგრამ მის სულში ასეთი სურვილი ყოველთვის არსებობს.

რა ჰქვია ახალ სერვისს «წამლების დაბლოკვა» ? როგორც სახელი გვთავაზობს, პროფილის პირადი შეტყობინებების სექცია რაღაცით იქნება გაჭედილი. მეტიც, ეს იქნება არა სპამი ან ცარიელი SMS, არამედ შეტყობინებები რეალური მომხმარებლებისგან! როდესაც შეხვალთ თქვენს პროფილში მიიღებთ ათობით ახალ პირად შეტყობინებას … თქვენზეა დამოკიდებული, რომ წაიკითხო თუ არა, მაგრამ მთავარია, რომ ისინი რეგულარულად მოვლენ და შენი რამდენჯერმე გაიზრდება.

როგორ მუშაობს სერვისი და რა საჭიროა პირადი შეტყობინებების დაბლოკვისთვის?

იმისათვის, რომ თქვენი წერილის საქაღალდე რეგულარულად შეივსოს, საკმარისია მხოლოდ ერთი ღილაკის დაჭერით! უკვე დარეგისტრირებული ხართ Ad-Social სერვისში, უბრალოდ გადადით შესაბამის განყოფილებაში და დააჭირეთ ღილაკს «Беги».ამის შემდეგ, თქვენ წაგიყვანთ იმ მომხმარებელთა სიაში, რომელთაც თქვენსავით სურთ მიიღონ შეტყობინებები. ამ ჩამონათვალის არჩევა ხდება შემთხვევით, რაც ნიშნავს, რომ მასში სრულიად უცხოები იქნებიან.

ამ სიიდან გასვლა ისეთივე მარტივია, როგორც მასზე მოხვედრა. ამისათვის უბრალოდ დააჭირეთ ღილაკს «ამოშალეთ სიიდან». წაშლა ხელს არ შეგიშლით მასში კვლავ გაწევრიანებაში! ვინ იცის, იქნებ ხვალ მოინდომოთ მომხმარებლებისგან შეტყობინებების მიღება და უფრო და უფრო ახალი დიალოგების შექმნა. არ გჭირდებათ ვინმეს კითხვა, ქსელში მყოფი მომხმარებლები Ad-Social სერვისის წყალობით თავად გიპოვნიან.

ახლა თქვენ არ გჭირდებათ ვინმეს დაბომბვა ისეთი მოთხოვნებით, როგორიცაა: «ნაგავი წამლები» ან «გამომიგზავნეთ შეტყობინება». საკმარისია შეხვიდეთ Ad-Social სერვისზე და დააჭიროთ ღილაკს «მონაწილეობა» მხოლოდ ერთხელ. თქვენ მოხვდებით იმ მომხმარებელთა სიაში, რომელთაც სურთ გაგზავნონ შეტყობინება. თუ სხვა მომხმარებელი დააჭერს ღილაკს «გაშვება», ეს არ არის იმის გარანტია, რომ ის გამოგიგზავნით შეტყობინებას. მიუხედავად იმისა, რომ მომსახურება აგებულია გულახდილ, ურთიერთსასარგებლო კომუნიკაციაზე, ის ძალიან ეფექტურია.ყოველივე ამის შემდეგ, სიაში თითოეულ წევრს სურს რაც შეიძლება მეტი შეტყობინების მიღება!

«Засорение ნარკოტიკების» სერვისის გამოყენების შედეგად, თქვენ გაქვთ ბევრი დიალოგი და ეს რიცხვი გაიზრდება, თუ თქვენს აპლიკაციას კვლავ დატოვებთ. ფულის გამომუშავების მიზანი არ არის, მაგრამ არსებობს რაც შეიძლება ბევრი წაუკითხავი შეტყობინების ნახვა ВКонтакте-. დაინტრიგდა? შემდეგ დააჭირეთ ღილაკს «მონაწილეობა» და დაიჭირეთ ახალი შეტყობინებები თქვენს პროფილში!

ვიდეო ინსტრუქცია, თუ როგორ უნდა დაიბლოკოს ВКонтакте ნარკოტიკები

სოციალური ქსელების გაჩენისთანავე, ჩვენი ცხოვრება გამარტივდა, ახლა აღარ არის საჭირო წერილის გაგზავნა და პასუხის დალოდება.მაგრამ ამავდროულად, ინტერნეტში კომუნიკაციაც შეიცვალა, იგი უფრო გამარტივდა და გაუგებარი გახდა. თუ ჯერ კიდევ არ იცით რა არის პრეპარატი VK- ში მაშინ ეს სტატია დაგეხმარებათ.

რა არის ВКонтакте LAN

დღესდღეობით ახალგაზრდებს აქვთ საკუთარი ენა საკუთარი იდეების და აზრების გამოსახატავად, ზოგჯერ ეს ყველასთვის გასაგები არ არის. სოციალურ ქსელში შეიძლება შეგხვდეთ მილიონი განსხვავებული და გაუგებარი სიტყვა, ზოგჯერ გაინტერესებთ საიდან მოდის ეს სიტყვები? «ახალგაზრდული ჟარგონის» ერთ-ერთი მაგალითია LS.სოციალურ ქსელებში შეგიძლიათ იხილოთ შეტყობინებები, როგორიცაა «HP- ზე ბმული ჩამოაგდეს» ან «HP- მომწერე». და იწყებ ფიქრს, სხვა რა ნარკოტიკია? მაგრამ ეს ძალიან მარტივია ВКонтакте LAN არის პირადი შეტყობინებები.

• გადადით იმ პირის გვერდზე, რომელთანაც გსურთ ესაუბროთ.
• დააჭირეთ «წერილის დაწერას».
• შეიყვანეთ თქვენი წერილი და დააჭირეთ ღილაკს «».

Ახლა შენ იცი, რა არის LAN VK- ში და როგორ შევა იგი … ამიტომ, ნუ დააყოვნებთ მისწერათ ნებისმიერს, ვისაც გსურთ.

რა მოხდება, თუ ვერ ვწერ შეტყობინებას?

ბევრისთვის ისე ხდება, რომ დიალოგის კუთხეში ვინმესთვის წერილის გაგზავნის შემდეგ, «შეცდომა» ჩნდება.

• პირველი, არ პანიკა. შეეცადეთ განაახლოთ გვერდი თქვენს ტაბლეტზე ან ტელეფონზე, თუ ამის შემდეგ არაფერი შეცვლილა, მაშინ უნდა გაასუფთაოთ «ქეში» ან «ქუქი» (ქუქი-ფაილები). თქვენი ბრაუზერისგან დამოუკიდებლად, თქვენ უნდა გადახვიდეთ «პარამეტრებში» და დააჭირეთ მონიშნულ «cache» და «cookie» და გაასუფთავეთ ისინი.
• მეორეც, ზოგჯერ ხდება ისე, რომ ეს სულაც არ ეხება თქვენს სმარტფონს ან ტაბლეტს. Вконтакте- ს ყველა მომხმარებელს აქვს შესაძლებლობა დახუროს წვდომა მათ შეტყობინებებზე, ანუ მეგობრების გარდა ვერავინ მისწერს ამა თუ იმ პირს. მაგრამ ამაზე ნუ დარდობ, უბრალოდ დაამატე ეს ადამიანი, როგორც მეგობარი და შემდეგ შეგიძლია მისწერო მას.

ასე შეიტყვეთ რა არის პრეპარატი და სად შეიძლება იპოვოთ იგი. ვიმედოვნებ, რომ ეს სტატია დაგეხმარებათ ყველა თქვენს კითხვაზე პასუხის გაცემაში. მაგრამ ისე, რომ ხალხმა უფრო გაგიგოს, სწორად დაწეროს, ყოველგვარი აბრევიატურა და შეცდომის გარეშე, შემდეგ შენ არ გექნება უხერხული სიტუაცია.

Вконтакте- ისეთი მოდის, რომ თუ ბევრი წაუკითხავი შეტყობინება გაქვთ, მაშინ პოპულარული ხართ! ჩნდება კითხვა — როგორ დაასრულოს შეტყობინებები VK უფასოდ ? სირცხვილი არ არის თქვენი გვერდის ჩვენება მეგობრებისთვის და სხვა მიზნებისთვის ეკრანზე გამოტანა.

ძველ დიზაინზე ყველა კორესპონდენცია შეიძლება აღინიშნოს, რომ არ არის წაკითხული, მაგრამ ახალი დიზაინი ამის საშუალებას არ იძლევა. ამიტომ, დაუყოვნებლივ გადავალთ შემდეგ მეთოდზე.

კომენტარები ჯგუფებში VK- ში

ვკონტაქტეზე არის სპეციალური ჯგუფები, რომლებიც აერთიანებენ თქვენნაირ ადამიანებს.ვისაც სურს წაუკითხავი შეტყობინებების მოტყუება. მათ შორის ყველაზე პოპულარულებს «Помет LS» უწოდებენ, სადაც უნდა წახვიდეთ და რამე დაწეროთ.

ჯგუფებთან დასაკავშირებლად კიდევ ერთი გზაა სათამაშო პუბლიკის პოვნა და წერილის დაწერა, სადაც უფასოდ საინტერესო ინფორმაციას შემოგთავაზებთ, მაგალითად, თამაშის ან ანგარიშის გასაღები. ვინაიდან მოთამაშეები აქტიურები არიან, ისინი სწრაფად დაწერენ ასობით კომენტარს.

ამოცანები ВК- ში შეტყობინებების მოტყუებისთვის

არსებობს სპეციალური გაცვლითი სამუშაოები, სადაც ნებისმიერს შეუძლია შეასრულოს თქვენი მოთხოვნა შეტყობინებების დასაწერად VK.ამასთან, არსებობს რამდენიმე ასეთი გაცვლა, სადაც ასეთი ამოცანები არსებობს.

როგორ მუშაობს სამუშაოს გაცვლა?
ჩვენ ვასრულებთ დავალებას, ვთქვათ, რომ მოგვწონს. ამის შემდეგ, ჩვენ ვიღებთ ქულებს ანგარიშზე, რომელიც შეიძლება დაიხარჯოს მსგავსი ამოცანის «ნაგვის წამლები» შექმნაზე.

არის ერთადერთი სერვისი, რომელიც უზრუნველყოფს ასეთ მომსახურებას. საკმაოდ მარტივი და მოსახერხებელი მომსახურება, როგორც თავად ხედავთ. სხვათა შორის, ძალიან სწრაფად გადის შეტყობინებები ცოცხალი ხალხისგან.

მოატყუეთ შეტყობინებები VK– ში, ბოტების გამოყენებით

და ბევრი ახალი შეტყობინების მიღების ბოლო გზა არის პროგრამების გამოყენება, რაც ბევრს არ მოსწონს იმის გამო, რომ თქვენთან ურთიერთობენ ბოტები, რის შემდეგაც შეიძლება დაბლოკილი მომხმარებლები გახდნენ და ვის სჭირდება ასეთი წერილები?

ამიტომ, ჩვენ ვიყენებთ თაღლითობის ერთ-ერთ საუკეთესო პროგრამას VK- ში, გარდა ამისა, ის პირველად არის უფასო, რაც ზუსტად გვჭირდება! ეწოდება — BroBot , მისი ნახვა შეგიძლიათ ოფიციალურ ვებ -.

სად შეგიძლიათ დაასრიალოთ 200, 300, მაგრამ მინიმუმ 10,000 ასო. მთავარია პროგრამა გამოიყენოთ, სანამ თავისუფალი დროა. წინააღმდეგ შემთხვევაში, თქვენ შემდგომი თანხის გადახდა მოგიწევთ სატარიფო გეგმების გამოყენებისათვის.

ლიჩკა — რა არის ეს? როგორ დავწეროთ პირადში? აქ განმარტებულია.

რა არის პირადი?

რას გულისხმობთ «პირადში», «პირადში დაწერეთ»? ლიჩკა არის პირადი შეტყობინებები. არის შეტყობინებები სოციალურ ქსელში, რომელსაც მხოლოდ ორი ადამიანი ხედავს — თქვენ და ის, ვისთანაც გზავნით შეტყობინებებს.ზოგჯერ PM- ს უწოდებენ «LS» ან «л / с» — გასაგებია, რომ ეს იგივეა პირადი შეტყობინებები. «HP- მისწერა» ან «PM- ს მივწერო» ნიშნავს პირად შეტყობინებებში დაწერის მოთხოვნას.

გარეშე პირები ვერ ხედავენ პრემიერ მინისტრს. ეს განსხვავდება პრემიერ მინისტრისგან კომენტარისგან — ზოგჯერ კომენტარებში ადამიანები ერთმანეთთან ურთიერთობენ, როგორც ჩანს, და ყველა ხედავს მათ დიალოგს. პირადი შეტყობინებები პირადია, რადგან მიმოწერაში (დიალოგში) მხოლოდ ორი მონაწილე ხედავს მათ.

ლიჩკა არის ВКонтакте, Одноклассники, Facebook და ბევრ სხვა საიტზე.

როგორ დავწეროთ პირადში?

ასეთია: გახსენით ადამიანის გვერდი, იპოვნეთ იქ ღილაკი «წერილის დაწერა», დაწერეთ და გაგზავნეთ. ნახვა:

და თუ მანამდე მისწერე მას, ან მან მოგწერა, შეგიძლიათ იპოვოთ დიალოგი თქვენს «შეტყობინებებში» და დაწეროთ იქიდან — სხვაობა არ არის.

როდესაც გსურთ დაწეროთ ის ადამიანი, ვისთანაც უკვე დაწერეთ, უბრალოდ გადადით თქვენი შეტყობინებების განყოფილებაში და იქ მასთან დიალოგი. დააჭირეთ ამ დიალოგს მის გასახსნელად, დაწერეთ ახალი შეტყობინება და გაგზავნეთ.

რატომ ვერ ვწერ პირადში?

პირადი შეტყობინების გაგზავნა ყოველთვის არ არის შესაძლებელი. ადამიანს შეეძლო პირადი პერსონალის დახურვა — მაგალითად, მხოლოდ მეგობრებისთვის დაეტოვებინა ეს. ამავდროულად, სხვები, ვინც მასთან არ არიან მეგობრები, ვერ წერენ მას ლ / წმ-ით.ეს არის ყველაზე გავრცელებული შემთხვევა და პასუხი კითხვაზე «რატომ ვერ ვწერ პირადში». Რა უნდა ვქნა? თუ თქვენ ნამდვილად გჭირდებათ კონტაქტი ადამიანთან, სთხოვეთ მის მეგობრებს, უთხრათ მას ან იპოვნეთ მასთან კონტაქტის სხვა გზა.

ზოგჯერ ადამიანები ამბობენ, რომ «პირადში დაწერე», მაგრამ მათ ავიწყდებათ ან არ ესმით, რომ მათი პერსონა დახურულია. ჩვენ მოგვიწევს გარკვეული სიგნალის მიცემა, რომ გახსნან. მაგალითად, დაწერეთ კომენტარებში ან დარეკეთ. იხილეთ, მაგალითად, როგორ მივწეროთ ადამიანს ВКонтакте- ზე, თუ მისი პირადი ანგარიში დახურულია.

დახურეთ, გახსენით პირადი — როგორ უნდა გავიგოთ ეს?

• PM- ს დახურვა — ნიშნავს აკრძალვა სხვა ადამიანები (ყველა ან უბრალოდ არამეგობრული) გიწერენ პირად შეტყობინებებს.
• გახსენით PM — პირიქით, ნიშნავს დაუშვას სხვა ადამიანები, რომ დაგიწერონ პირადი შეტყობინებები.

თუ როგორ უნდა დახუროთ ან გახსნათ PM, VK– ში შეგიძლიათ გაიგოთ აქ: როგორ უნდა დახუროთ ან PM, როგორ დაიმალოთ ინფორმაცია თქვენს VK გვერდზე — ეს ეხება კონფიდენციალურობის პარამეტრებს, რომელთა შორის არის ადამიანთა წრის შეზღუდვა, რომელთაც შეუძლიათ მოგწეროთ L / S– ში.

რატომ არ პასუხობს პიროვნება პირად შეტყობინებაში? როდის მიპასუხებს?

უპასუხებს, როცა მოისურვებს. თუ არ სურს, საერთოდ არ უპასუხებს. მას არაფერი ავალდებულებს გიპასუხოს. თქვენ შეგიძლიათ დაადგინოთ, წაიკითხა მან თუ არა თქვენი შეტყობინება: იხილეთ აქ — ВКонтакте შეტყობინებები — ახალი, წაუკითხავი, წაშლილი. ამ ინსტრუქციის წაკითხვის შემდეგ, თქვენ გაიგებთ, თუ როგორ უნდა განასხვავოთ წაკითხული წერილი წაუკითხავიდან.

კიდევ რას ნიშნავს «ПМ»?

ზოგჯერ მესენჯერში შეტყობინებებს (შეტყობინებების პროგრამა) უწოდებენ პირად შეტყობინებებს.პოპულარული მესინჯერია: Telegram, Whatsapp, Viber და სხვები. Facebook- სა და VK- ს აქვთ ცალკეული მესინჯერები, სადაც მხოლოდ მიმოწერაა და ახალი ამბების არხი.

ჩვეულებრივ, თუ ადამიანი იმყოფება თქვენი ტელეფონის კონტაქტების სიაში, მაშინ მას მარტივად ნახავთ რომელიმე მესინჯერში (რა თქმა უნდა, თუ ის ამას იყენებს).

როგორ გაერკვნენ, თუ რა მომწერეს მათ პირად შეტყობინებაში?

თუ თქვენ მიდიხართ ВК ან Одноклассники- ში და ხედავთ ხატს სიტყვის «შეტყობინებები» გვერდით (მაგალითად, ნომერი «1»), მაშინ ვინმემ მოგწერა პირადი შეტყობინებით.ნომერი ნიშნავს რამდენი ახალი შეტყობინება გაქვთ. დააჭირეთ «შეტყობინებებს» და იქ წაიკითხავთ იმას, რაც მათ მოგწერეს და ვინ დაწერა. ახალი შეტყობინებები ნაჩვენებია «შესვლის» საწყის გვერდზე — მაშინ როდესაც თქვენ არც კი გჭირდებათ ВК ან Одноклассники– ზე გადასვლა, ანუ თქვენ უხილავი რჩებით, ხალხი ვერ ხედავს თქვენ ინტერნეტით. სცადეთ, ეს ძალიან მარტივი და მოსახერხებელია.

chsv — što znači pojam

Društvene mreže uvele su u jezik mnogo pojmova, jedan od njih je bio ChSV. Teško je saznati što to znači i gdje se primjenjuje ako osoba ne zna za dekodiranje, a nitko mu ne može reći.Internetski sleng koristi skraćenicu ČSV samo da bi ukazao na pretjeranu značajnost protivnika.

Это значащие ЧСВ и как сэ дешифрира

Први пут сь у руском говорящем интернету появила комбинат ЧСВ — это меню поштователя Карлоса Кастанеде —шпаньольский эзотеричног и мистический. U knjigama je opisao moralno uzdizanje nad другом особом у govoru, a ne djelima. Zainteresirani za skraćenicu ChSV — što znači kratica? Ова три письма открываю се као «осьещай властите важности». Inače, CSR se može nazvati vrednovanjem sebe, od kojeg je teško riješiti se.

Zbog činjenice da osoba stalno visoko vrednuje svoju važnost i dostojanstvo, Потребно е доста времени, ometa trezveni pogled na situaciju i donošenje odluke. Prema ezoteričnim knjigama, osjećaj samodostatnosti je negativan, potrebno ga je riješiti, jer uključuje mnogo energije, ostavljajući samo snagu da slejedi društvene Recepte i konvencije.

Precijenjen ChSV u društvenim mrežama

Često se upotrebljava izraz SCV na društvenim mrežama, когда вы можете найти публикации на фотографиях.Аналогия кратице су pojmovi arogancija, arogancija i ponosa. Ljudi s osjećajem vlastite važnosti stalno prestavljaju svoje zasluge friendima. Zanemarivanje njihovih zasluga također ukazuje na pretjerani osjećaj vlastite važnosti.

Još jedna mogućnost u kojoj možete upoznati termin — онлайн-игра. Tamo se koristi friendačije — u različitim vrstama igara, ali se često spominje u kontekstu slčnom društvenim mrežama. Igrač sa megalomanijom, precjenjivanjem sebe i svojih sposobnosti, arogancije i narcizma zaslužuje «nagrađivanje» ovog opisa.Od online karakteristike odlazi u život, manestirajući se kao hvalisanje i ambicija. Riješiti ga je teško.

Это значащий CSV ВКонтакте

Nisu svi ljudi znali sto je CSV u VK. O ovom osjećaju, svojstvenom osobi, možete naučiti sljedeće manifestacije:

• osoba je ponosna na sebe, smatra se važnim, stavlja mišljenje iznad riječi другие;
• taština, ambicija, pretjerani osjećaj dostojanstva;
• osoba nije u stanju čuti kritiku;
• ne može razumjeti ljude normalno, razgovarati s njim je teško;
• захтиева максимальное предоставление према себи, чак я недостатку других случаев;
• neprestano skreće pozornost na svoj račun — komentare čuva za sebe, voli svoje bilješke, piše mnogo članaka, оставшаяся спойлер у киноским рецензияма, не poštujući željenjenjédi išludi.

Tko je takva Dota?

Как вам быть естественной игрой Dota 2, онда не би било лоши знати боле: CHSV — это значи када комуникации с другим коридором? Сви игры постижу различите разине вйештине, это можно использовать сукобе у разговору по изменению найболих и оних коди су лоший. Većina pobjednika može se pohvaliti nevjerojatnom razinom majstorstva i može ih se okriviti za pretjerano.

Osjećaj vlastite važnosti podrazumijeva da osoba uvelike pretjeruje i uzdiže svoju važnost or vještinu, demonrirajući otherima oko nepostojećih talenata.Igrač ima agresiju na bilo koju riječ или akciju, jer u stvari, on također sebe smatra inferiornim. Osoba s Precijenjenim osjećajem važnosti u DotA-i je previše ovisna o mišljenjima other, daje mu veliku pozornost i stoga je uzaludna.

Što je mračno doba?

Još jedna popularna igra — Dark Age — у odjeljku popularnih pitanja odgovori o CSW — što ovaj pojam значи. Значи брой воды. Svaki igrač ima mjesta — stvari koje povećavaju važnost igre i razinu zaštite.Značajne kategorije uključuju same stvari, oštrenje, dragulje. Što je više takvih mjesta na igraču, to je njegova snaga veća. Вы можете узнать больше о Тиме изравненно на Dark Age MMORPG web-lokacijama.

Broj stvari se izražava kvantitativno, što je zbroj svih raspoloživih stavki. Odjeća, kamenje, vještine, predmeti koje kućni ljubimci i konji mogu utjecati na to. Broj Paratara Snage Stvari izravno Ovisi o Broju Stečenih or Primljenih amuleta, čarobnih predmeta. Možete povećati njihovu razinu oštrenjem, ukrašavanjem dragim kamenjem i kamenjem, pretapanjem.

Видео: опасность од власти