Чсв мем: Комикс мем: «Что такое ЧСВ?» — Комиксы

• При наличии продромальных симптомов может предотвратить полномасштабный приступ.
• Доза – например:
  • Валацикловир 500 мг TDS в течение 5 дней
  • Ацикловир – 400 мг TDS в день в течение 5 дней.
  • Рассмотрите возможность более длительного лечения, если симптомы еще не исчезли
• Крем ацикловир для местного применения может быть назначен пациентам в период между приступами, чтобы использовать их, как только появятся симптомы приступа.
• У пациентов, которым желательна длительная профилактическая («подавляющая») терапия:
  • Валацикловир 500 мг 1 раз в сутки внутрь в течение 6 месяцев
  • Пересматривать потребность в супрессивной терапии каждые 6 месяцев – частота и тяжесть обострений имеет тенденцию к снижению со временем поражения присутствуют, но также могут наблюдаться при отсутствии поражений

  Другие поддерживающие меры

  • Гель лигнокаина для местного применения может уменьшить боль от поражений
  • Ванны с солевым раствором могут успокаивать
  • Простое обезболивание
  • Дайте письменную подтверждающую информацию о диагнозе

  Отслеживание контактов не рекомендуется

  Ссылки

  • Общая практика Муртага. 6-е изд. (2015) Джон Муртаг, Джилл Розенблатт
  • Оксфордский справочник по общей практике. 3-е изд. (2010) Саймон, К., Эверитт, Х., ван Дроп, Ф.
  • Бирс, М.Х., Портер Р.С., Джонс, ТВ., Каплан Дж.Л., Берквитс, М. Руководство Merck по диагностике и терапии
  • Герпес — Австралийское руководство по ИППП

  Узнайте больше о наших источниках

  Статьи по теме

  Теги: Инфекционные заболевания, Акушерство и гинекология

  Доктор Том Лич

  Доктор Том Лич в настоящее время работает как aFRACChB DMCH EMCert Врач общей практики и директор по маркетингу отделения неотложной помощи в Австралии. Он также является клиническим младшим лектором в Австралийском национальном университете и учится на степень магистра спортивной медицины в Университете Квинсленда. После получения медицинской степени в Манчестерском университете в 2011 году Том прошел базовое обучение в Королевской больнице Болтона, а затем переехал в Австралию в 2013 году. Он стал почти врачом, будучи студентом третьего курса медицинского факультета в 2009 году. . Читать биографию полностью

  Нуклеопротеин вируса простого герпеса создает конкурентную транскрипционную среду, способствуя надежной транскрипции вируса и отключению хозяина

  Abstract

  Вирус простого герпеса-1 (ВПГ-1) реплицируется в ядре, используя механизм РНК-полимеразы II (Pol II) хозяина для производства вирусных мРНК, что приводит к отключению транскрипции хозяина. Механизм, стоящий за этим быстрым перепрограммированием транскрипционной среды хозяина, в значительной степени неизвестен. Мы идентифицировали ICP4 как ответственного за преимущественное привлечение механизма Pol II к вирусному геному. ICP4 представляет собой вирусный нуклеопротеин, который связывает двухцепочечную ДНК. Мы определили, что ICP4 избирательно связывается с вирусным геномом из-за отсутствия клеточных нуклеосом и высокой плотности родственных сайтов связывания. Мы утверждаем, что способность ICP4 рекрутировать не только Pol II, но и более ограниченные важные компоненты, такие как ТВР и Медиатор, создает конкурентную транскрипционную среду. Эти отличительные характеристики в конечном итоге приводят к быстрому и эффективному перепрограммированию транскрипционного аппарата хозяина, чего не происходит в отсутствие ICP4.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109.001

  Введение

  Как и большинство ДНК-вирусов, геном вируса простого герпеса-1 (ВПГ-1) транскрибируется РНК-полимеразой II (Pol II) (Alwine et al., 1974). Приблизительно 85 его генов (McGeoch et al., 1988; McGeoch et al., 1986; McGeoch et al., 1985) транскрибируются в согласованной во времени последовательности, так что их белковые продукты экспрессируются в соответствующее время жизненного цикла. вирус (Хонесс и Ройзман, 1974а; Хонесс и Ройзман, 1974b; Хонесс и Ройзман, 1975). Продукты непосредственно ранних (IE) генов обеспечивают эффективную экспрессию ранних (E) и поздних (L) генов. Белковые продукты генов Е в основном участвуют в репликации ДНК. Репликация ДНК и белки IE обеспечивают эффективную транскрипцию генов L, которые кодируют структурные компоненты вируса. Репликация ДНК лицензирует промоторы L, позволяя связывать основные факторы транскрипции Pol II, тем самым активируя инициацию транскрипции L (Dremel and DeLuca, 2019).). Весь этот транскрипционный каскад наблюдается в течение 3 часов (h) после проникновения (Dembowski and DeLuca, 2018; Dremel and DeLuca, 2019), достигая кульминации в образовании первого вирусного потомства между 4 и 6 часами после заражения (hpi). Чтобы выполнить эту надежную и быстро меняющуюся программу транскрипции, вирусный геном должен конкурировать с гораздо более крупным клеточным геномом за многочисленные факторы транскрипции Pol II, в дополнение к опосредованию возможных ограничений клеточных гистонов.

  Основным компонентом этого каскада является белок IE Infected Cell Polypeptide 4 (ICP4) (Courtney and Benyesh-Melnick, 1974). ICP4 необходим для роста вируса, поскольку он способствует эффективной транскрипции вирусных генов E и L (Dixon and Schaffer, 1980; Preston, 1979; Watson and Clements, 1980). Таким образом, в отсутствие ICP4 белки E и L плохо экспрессируются, белки IE продуцируются в избытке, репликация ДНК не происходит, и нет определяемого выделения вируса (DeLuca et al. , 1985). Впервые было показано, что ICP4 связывается с ДНК-целлюлозой, полученной из ДНК спермы лосося (Powell and Purifoy, 1976). Фабер и Уилкокс (1986) позже показали, что ICP4 обладает специфичной для последовательности ДНК-связывающей активностью. ICP4 взаимодействует с рядом клеточных факторов общей транскрипции (GTF), преимущественно с компонентами TFIID и комплекса Mediator (Carrozza and DeLuca, 19).96; Лестер и ДеЛука, 2011 г .; Wagner and DeLuca, 2013), способствуя их рекрутированию в вирусный геном благодаря своей ДНК-связывающей активности (Dembowski and DeLuca, 2018; Lester and DeLuca, 2011; Sampath and Deluca, 2008). ICP4 синтезируется на ранней стадии инфекции, связывается с вирусным геномом, расположенным в структурах ND10 (Everett et al., 2003), и остается связанным с геномом на протяжении всех фаз инфекции (Dembowski and DeLuca, 2018). Таким образом, ICP4 может влиять на события, происходящие в вирусном геноме, начиная с момента, когда количество геномов минимально, а экспрессия ICP4 достигает пика, до момента, когда количество геномов значительно увеличивается за счет репликации.

  Исследования также показали, что эпигенетическая модуляция гистонов, связанных с вирусным геномом, на ранней стадии инфекции может влиять на продуктивную вирусную инфекцию (Knipe and Cliffe, 2008; Liang et al., 2009). Однако мы показали, что количество гистонов относительно низкое или отсутствует, и что ICP4 является одним из наиболее распространенных белков в вирусных геномах во время продуктивной инфекции (Dembowski and DeLuca, 2015). В этом исследовании мы намеревались определить взаимосвязь между ICP4 и гистонами, связывающимися с вирусным и клеточным геномами, а также последствия для вирусной и клеточной транскрипции. Мы предполагаем, что ICP4 является основным компонентом вирусного нуклеопротеина, который функционирует вместо традиционного клеточного хроматина и обеспечивает надежное привлечение клеточных транскрипционных факторов конкретно к вирусному геному.

  Результаты

  Связывание ICP4 изменяется репликацией вирусного генома

  Учитывая центральную роль ICP4 в транскрипции вирусных генов на всех стадиях инфекции, нас интересовало, как ICP4 взаимодействует с геномом вируса по мере экспоненциального увеличения числа в результате репликации. Мы заразили клетки фибробластов человека (MRC5) ВПГ-1 дикого типа (KOS) для двух, четырех и шести hpi и выполнили ChIP-Seq для ICP4. Каждая временная точка представляет собой разное состояние репликации: два hpi (до репликации), четыре hpi (3–4 дупликации генома), шесть hpi (5–6 дупликаций генома) (рис. 1А). Для количественного сравнения образцов нам пришлось учитывать репликацию вирусного генома. Входные образцы предоставили относительное количество вирусных геномов, присутствующих в каждый момент времени. Мы использовали это отношение для нормализации образца иммунопреципитации (IP) по количеству фактора на геном. В начале инфекции (два HPI) ICP4 плотно покрывал вирусный геном (рис. 1B-C). Репликация вирусного генома уменьшала количество ICP4, связанного с геномом (рис. 1A-B), что приводило к паттерну, содержащему более острые пики. К шести hpi связывание ICP4 сохранялось исключительно на мотивах сильного связывания ICP4 (рис. 1C). Некоторые из сохраненных сайтов связывания были ранее установлены как оказывающие ингибирующее действие на связанный с промотором гена, включая ORF P, ICP4 и LAT (рис. 1D). Более тщательный анализ пиков ICP4 показал, что расположение и количество занятых участков с высокой достоверностью существенно не менялись на протяжении всего заражения (рис. 1E). Вместо этого количество ICP4, связанного между отдельными пиками, уменьшалось по мере увеличения числа геномов (рис. 1C-D).

  Связывание

  ICP4 в ключевых точках жизненного цикла вируса.

  клеток MRC5 инфицировали ВПГ-1 в течение 2, 4 или 6 ч и выполняли ChIP-Seq для ICP4. ( A ) Количественное определение вирусных геномов, измеренное как вирусные картированные чтения (MR) входного образца, нормализованные по глубине секвенирования или Total Reads (TR). Образцы были нормализованы до двух единиц HPI, что было принято за 1. ( B ) Количественное определение связывания ICP4 на вирусный геном, измеренное как MR вируса из иммунопреципитации ICP4 (IP) на MR вируса из исходных данных. ( C – D ) Все данные были нормализованы по глубине секвенирования и количеству вирусного генома с использованием входных прочтений ChIP-Seq. Указаны вирусные ORF, кодированные цветом по классу генов: IE — желтым, E — зеленым, поздние протечки (L1) — синим, а истинно поздние (L2) — фиолетовым. Поиск отдельных вхождений мотивов (FIMO) идентифицированные последовательности генома, совпадающие с консенсусным мотивом в B, обозначены красным. ( E ) Пересечение MACS2 определило занятые области ICP4. ( F ) Консенсусный мотив связывания ICP4.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109.002

  Хотя ICP4 демонстрировал плотную структуру связывания на ранних этапах (два hpi), с относительно широкими перекрывающимися пиками мы смогли определить сайты связывания с высокой степенью достоверности. Конечные сайты были одинаковыми между биологическими повторами. Мы проанализировали отростки длиной 100 п.н. от вершин пиков, наблюдаемых все три раза (рис. 1Е), для обнаружения мотива. DTSGKBDTBNHSG был единственным обнаруженным мотивом (рис. 1F), где D представляет собой A, G, T; S представляет собой C или G; К представляет собой G или Т; В представляет собой С, G, Т; H представляет собой A, C, T. Этот мотив связывания аналогичен мотиву, обнаруженному ранее с использованием методов in vitro, RTCGTCNNYNYSG (DiDonato et al., 19).91).

  Эти результаты показывают, что ICP4 связывается со специфическими участками, но также покрывает геном на ранних стадиях инфекции, образуя тип нуклеопротеина. Из-за массового действия нуклеопротеин ICP4 изменяется по мере развития инфекции, ограничивая связывание преимущественно сильными родственными сайтами связывания по мере увеличения числа геномов из-за репликации.

  ICP4 стабилизирует связывание GTF, способствуя сборке кооперативного комплекса преинициации (PIC)

  Мы хотели исследовать, как образование нуклеопротеина ICP4 влияет на ландшафт факторов транскрипции в вирусном геноме. Мы сравнили связывание ICP4, Pol II, ТАТА-связывающего белка (TBP), SP1, Med1 и Med23 в фибробластах человека, инфицированных ICP4 null (n12) и дикого типа (WT) HSV-1, при 2,5 hpi с помощью ChIP-Seq. (Рисунок 2—дополнение к рисунку 1). Во всех IP Pol II мы использовали антитело, которое преимущественно связывается с фосфо S5 С-концевой области повтора домена. Эта посттрансляционная модификация связана с Pol II, обнаруженным на промоторах мРНК и сайтах сплайсинга.

  При инфекции n12 мы наблюдали снижение связывания всех факторов с большинством вирусных промоторов, за исключением генов IE (рис. 2A–B), где связывание увеличивалось. Были обнаружены, хотя и сильно сниженные, пики связывания ТВР и SP1 с промотором UL23 в отсутствие ICP4. Ранее было показано, что эти сайты функционируют на фоне n12, отражая базальную связывающую активность TBP и SP1 (Imbalzano et al., 1991) (фиг. 2В). Подобно UL23, мы наблюдали связывание TBP и SP1 с селективными промоторами E в отсутствие ICP4, а именно UL23, UL29. , UL39 и UL50 (рисунок 2 — дополнение к рисунку 1).

  ICP4 рекрутирование механизма Pol II хозяина на вирусные промоторы.

  клеток MRC5 инфицировали нулевым мутантом ICP4 (n12) или HSV-1 (WT) в течение 2,5 ч и выполняли ChIP-Seq для ICP4, Pol II, ТВР, Sp1, Med1 и Med23. Все данные были нормализованы по глубине секвенирования и номеру вирусного генома с использованием входных прочтений ChIP-Seq. Указаны вирусные ORF, кодированные цветом по классу генов: IE — желтым, E — зеленым, поздние протечки (L1) — синим, а истинно поздние (L2) — фиолетовым. ( A ) Изменение кратности n12 по сравнению с WT, выровненным с вирусным геномом. Локусы с большим связыванием в n12 или WT окрашены в зеленый или красный цвет соответственно. ( B ) Чтения ChIP-Seq нормализованы по вирусному геному и выровнены с каноническими генами IE, E и L1.

  https://doi. org/10.7554/eLife.51109.003

  Было относительно небольшое количество прочтений в ICP4 ChIP n12 (рис. 2А, рис. 2 — дополнение к рисунку 1). Поскольку ICP4 является важным вирусным белком, мы подготовили запасы n12 в клеточной линии, комплементарной ICP4. ICP4 упакован в тегумент вирионов (Yao and Courtney, 1989), что приводит к упаковке ICP4 дикого типа в вирионы n12 (Dembowski and DeLuca, 2018). Чтения в ICP4 ChIP n12, скорее всего, связаны с ICP4, упакованным в вирион. Хотя конечный источник этих прочтений в настоящее время не ясен, степень связывания ICP4 из вириона с ДНК недостаточна для стимулирования транскрипционных комплексов на вирусных ранних и поздних генах.

  Med1 и Med23 связывались с вирусным геномом практически по идентичной схеме (рис. 2 — дополнение к рисунку 1, рис. 2), что указывает на то, что они являются частями медиаторного комплекса, связывающегося на ранней стадии вирусной инфекции. В клетках, инфицированных WT, связывание медиатора концентрировалось вблизи стартовых участков вирусных генов, индуцированных ICP4. Однако комплекс Mediator также плотно покрывает вирусный геном, напоминая схему связывания ICP4. Это плотное покрытие полностью отсутствовало при инфекции n12, демонстрируя, что этот фенотип не является артефактом IP. Мы подозреваем, что это отражает тот факт, что ICP4 и медиатор взаимодействуют.

  В отсутствие ICP4 связывание Pol II снижалось больше всего по сравнению с другими факторами транскрипции (фиг. 2А). Это увеличенное различие, вероятно, является результатом совместной природы рекрутирования Pol II, требующей множественных белок-белковых взаимодействий. Таким образом, ICP4 требовался для надежного рекрутирования всех протестированных GTF, совместно рекрутируя Pol II на промоторы E и L (рис. 2B). Разница между n12 и WT показывает степень, в которой ICP4 опосредует рекрутирование и поддерживает частоту сборки PIC. Промоторы IE сохраняли надежное рекрутирование GTF посредством независимого механизма, включающего комплекс, состоящий из Oct-1, HCF и VP16, связывающихся с элементами промотора TAATGARAT (Preston et al. , 19).88; Стерн и Герр, 1991; Стерн и др., 1989).

  ICP4, связанный с геномом, не влияет на доступность

  Часть механизма действия ICP4 при рекрутировании GTF в геном может заключаться в исключении репрессивного хроматина. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали взаимосвязь между присутствием ICP4, обилием гистонов и доступностью генома. Мы использовали ChIP-Seq для сравнения связывания ICP4, Pol II и гистона h4 в фибробластах человека, инфицированных n12 и WT HSV-1, при двух HPI (рис. 3). Мы обнаружили как при инфекции WT, так и при инфекции n12, что количество прочтений h4, сопоставленных с вирусным геномом, было в 100 раз меньше, чем ICP4, и картина была почти идентична входным прочтениям (рис. 3А), с R ² корреляции 0,0004 и 0,02 (рис. 3 — дополнение 1 к рисунку). Эти данные показали, что связывание h4 с вирусным геномом было минимальным и невоспроизводимым. Кроме того, связывание h4 было минимальным в отсутствие ICP4 (n12). Это не было связано с техническими проблемами, поскольку количество и качество прочтений h4, сопоставленных с клеточным геномом для тех же образцов, составляло приблизительно 10 миллионов с корреляциями R ² ≥0,97 (рис. 3 — дополнение к рисунку 2). Мы наблюдали аналогичную тенденцию с h4K4me3, h4K27ac, h4K9.чтения me3 и h4K27me3, сопоставленные с вирусным геномом (рис. 3 — дополнения к рисунку 1–3).

  ICP4-зависимость доступности вирусного генома и связывания гистона h4.

  клеток MRC5 были инфицированы нулевым мутантом ICP4 (n12) или HSV-1 (WT) и собраны до репликации генома. ( A ) ChIP-Seq для ICP4, Pol II, h4 и B-D) Была выполнена ATAC-Seq. Все данные были нормализованы по глубине секвенирования и номеру вирусного генома с использованием входных прочтений ChIP-Seq. ( C ) Количественный анализ данных ATAC-Seq, измеряющий относительное обогащение тегами вируса или хозяина по сравнению с ожидаемым. ( D ) График гистограммы размера фрагмента ATAC-Seq для прочтений, сопоставленных с вирусным (красный) или клеточным (черный) геномом. Фрагменты, защищенные мононуклеосомами, составляют примерно 180–250 п.н.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109.005

  Хотя связывание h4 с вирусным геномом было схожим при инфекции WT и n12, мы не могли исключить роль альтернативного белка, закрывающего геном. Чтобы исследовать доступность генома, мы выполнили ATAC-Seq. Фибробласты человека инфицировали WT и n12 HSV-1 при множественности заражения 10 БОЕ/клетку и собирали до начала репликации генома. Количественная оценка входных прочтений ChIP-Seq позволила нам определить, что приблизительное количество геномов на клетку при инфекции WT и n12 составляло 169 и 254 соответственно (рис. 3C). Это значение согласуется с заражением при множественности заражения 10 БОЕ/клетку и приблизительном соотношении частиц к БОЕ 20–30. Мы нормализовали кривые ATAC-Seq, чтобы скорректировать глубину секвенирования и номер входного генома. Мы наблюдали равномерную маркировку в обоих условиях (рис. 3B) без нуклеосомной лестницы, видимой в клеточном геноме (рис. 3D). Количественная оценка чтений ATAC-Seq определила, что вирусный геном у n12 и WT был в 2,2 и 2 раза более доступным, чем клеточный геном (рис. 3C). Поскольку мы собирали образцы перед репликацией, мы ожидаем, что значительная часть вирусных геномов дефектна и не будет подвергаться репликации. Таким образом, наши данные ATAC-Seq представляют собой среднее значение маркировки дефектных и активных вирусных геномов. По этой причине мы ожидаем, что наши расчеты доступности занижены. Мы пришли к выводу, что вирусный геном был намного более доступным, чем клеточный геном, и эта повышенная доступность не зависела от ICP4. Связывание ICP4 и рекрутирование GTF, а не доступность вирусного генома, были ответственны за надежное связывание GTF.

  ICP4 связывается с сайтами начала клеточной транскрипции (TSS) на ранних стадиях инфекции

  Иммунофлуоресцентные (ИФ) исследования инфекции ВПГ-1 показывают совместную локализацию ICP4 с вирусными геномами, меченными EdC, и исключение из плотных областей клеточного хроматина (Dembowski and DeLuca, 2015). Это явление настолько хорошо известно, что ICP4 широко используется в исследованиях IF в качестве прокси для геномов HSV-1. Чтобы убедиться, что ICP4 также связывается с клеточным геномом, мы сопоставили наши данные ICP4 ChIP-Seq от 2, 4 и 6 hpi с клеточным геномом. ICP4 связывается с клеточным геномом способом, совершенно отличным от паттерна, наблюдаемого в вирусном геноме. ICP4 связывается только в отчетливых пиках вокруг сайтов начала клеточной транскрипции (TSS) подмножества клеточных генов (рис. 4A-D). Эти гены онтологически сгруппированы по общим домашним функциям, включая пути, связанные с хроматином, транскрипцией и метаболизмом (рис. 4F). Это связывание уменьшилось с 2 до 4 hpi и стало незначительным при шести hpi (рис. 4A-B). При двух hpi ICP4 связывался с клеточным геномом в 5727 сайтах (рис. 4E) или 0,002 пика на т.п.н., тогда как ICP4 связывался с вирусным геномом в 122 сайтах (рис. 1E) или 0,8 пика на т.п.о. Аналогично, мы обнаружили гораздо большую плотность мотивов связывания ICP4, присутствующих в вирусном геноме (два мотива/т. п.н.), чем в клеточном геноме (0,02 мотива/т.п.н.). Мы наблюдали пики связывания ICP4, которые не локализовались на консенсусе связывания ICP4 (рис. 4А), что позволяет предположить, что ICP4 может связываться с клеточным геномом по альтернативному механизму. Мы пришли к выводу, что ICP4 связывается с клеточным геномом на ранних стадиях инфекции, когда относительная концентрация ICP4 по отношению к вирусным геномам еще достаточно высока. Количество ICP4 в клеточном геноме быстро падало по мере увеличения числа вирусных геномов, и ICP4 предпочтительно связывался с вирусным геномом.

  ICP4 связывает клеточные промоторы во время ранней инфекции.

  клеток MRC5 инфицировали ВПГ-1 в течение 2, 4 или 6 ч и выполняли ChIP-Seq для ICP4. Данные были сопоставлены с геномом человека (hg38) и нормализованы для образцов клеточного генома. ( A ) Репрезентативная область клеточного генома. Мотивы связывания ICP4 обозначены красным. ( B, D ) Центр данных секвенирования +/- 1 килобаз от сайта начала транскрипции (TSS) клеточных мРНК. ( C ) Данные секвенирования масштабированы от TSS мРНК до конечного сайта транскрипции (TES). ( E ) Пересечение MACS2 определило занятые области ICP4. ( F ) 10 наиболее обогащенных групп Reactome для генов (n = 2190) с ICP4, связанным с промотором через 2 часа.

  https://doi.org/10.7554/eLife.511090,009

  Связывание ICP4 ограничено доступными областями клеточного генома

  Поскольку ICP4 связывается с подмножеством клеточных генов вблизи стартовых участков мРНК (рис. 4), мы предположили, что ICP4 связывается только с доступными областями клеточного генома. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили ChIP-Seq для ICP4, Pol II, гистона h4 (h4), эухроматических маркеров h4K4-триметил (h4K4me3) и h4K27-ацетил (h4K27ac) и гетерохроматинового маркера h4K9. -триметил (h4K9me3) и h4K27-триметил (h4K27me3) на клетках MRC5, инфицированных ВПГ, в течение 2 часов. Клеточный TSS был стратифицирован с использованием кластеризации k-средних как высокого и низкого связывания ICP4 (рис. 5A). TSS с высоким связыванием ICP4 также связывались с Pol II и соседствовали с эухроматическими маркерами. TSS с низким связыванием ICP4 были связаны только с гетерохроматическими маркерами. Кроме того, гены, сгруппированные по высокому связыванию ICP4, имели более высокую частоту маркировки при оценке с использованием ATAC-Seq (рис. 5B). Данные были сопоставлены для репрезентативных клеточных генов на рисунке 5 — дополнение к рисунку 1. Мы количественно оценили взаимосвязь между ICP4 и клеточным хроматином на рисунке 5C-D. Мы обнаружили, что характер связывания ICP4 был напрямую связан (коэффициент Спирмена ≥0,5) с Pol II и клеточным эухроматином, кластеризуясь как наиболее похожий на h4K27ac и h4K4me3 (рис. 5C). Гетерохроматические маркеры, h4K9me3 и h4K27me3 сгруппированы вместе и не коррелировали (коэффициент Спирмена ~ 0) с ICP4 или клеточным хроматином. Эти результаты были подтверждены анализом отдельных пиков, называемых с использованием MACS (рис. 5D). Интересно, что области, связанные с ICP4, мало перекрываются с родственными мотивами связывания (рис. 5D). Более тщательный анализ фактической области генома, в которой связан каждый фактор, показал, что 82% областей, связанных с ICP4, находились в пределах 1 т.п.н. от промотора (рис. 5 — дополнение к рисунку 2). Для сравнения, только 10% мотивов связывания, предсказанных ICP4, находились в пределах 1 т.п.о. от промотора. Кроме того, эухроматиновые области клеточного генома, которые были заняты ICP4 в инфицированных клетках, также были эухроматическими в неинфицированных клетках, что указывает на то, что ICP4 глобально не способствует открытому хроматину в этих областях генома (рис. 5А-В). Эти данные подтверждают модель, в которой ICP4 способен неспецифически связываться с доступными областями клеточного генома, а именно с активными промоторами, на ранних стадиях инфекции, когда относительная концентрация ICP4 высока.

  Связь между клеточным связыванием ICP4 и хроматином.

  клеток MRC5 были неинфицированы или инфицированы ВПГ-1 в течение 2 часов. Все данные были приведены в соответствие с геномом человека (hg38) и нормализованы по глубине секвенирования. ( A, C–D ) Данные ChIP-Seq для ICP4, Pol II, h4, h4K4me3, h4K27acetyl, h4K9me3 и h4K27me3. ( B ) Данные ATAC-Seq. ( A–B ) Центр данных секвенирования +/- 1 килобаз от TSS клеточных мРНК. Данные были стратифицированы для связывания ICP4 с использованием кластеризации K-средних. ( C ) Корреляционный анализ Спирмена, ограниченный клеточными транскриптами. ( D ) Пересечение пиков MACS2, проанализированное как количество пересекающихся пиков или статистика Жаккара.

  https://doi.org/10. 7554/eLife.51109.010

  ICP4 опосредует истощение pol II на клеточных промоторах

  Мы наблюдали истощение связывания Pol II с клеточными промоторами при инфицировании (фиг. 5А). Это наблюдение согласуется с предыдущими исследованиями, в которых пострепликация инфекции ВПГ-1 оценивалась через три, четыре или шесть hpi (Abrisch et al., 2015; Birkenheuer et al., 2018; McSwiggen et al., 2019). Поскольку мы собирали образцы до начала репликации генома (два hpi), мы предположили, что виноват ICP4, который вырабатывается сразу после вирусной инфекции. Во-первых, мы определили влияние ICP4 на клеточные промоторы до начала репликации генома. Мы имитировали инфицированные или инфицированные фибробласты при 10 БОЕ/клетку WT или ICP4-null (n12) HSV-1 в течение 2 часов. Мы наблюдали истощение занятости Pol II на клеточных промоторах мРНК только при инфекции WT (рис. 6A-B). Таким образом, мы пришли к выводу, что ICP4 необходим для истощения Pol II от промоторов мРНК хозяина, и этот эффект не зависит от количества копий вирусного генома.

  Роль ICP4 в потере Pol II на промоутерах хозяина.

  клеток MRC5 были ( AB ) неинфицированными или инфицированными n12 или WT HSV-1 и собраны до репликации генома или C-D), инфицированными tsKos и выращенными в разрешающих условиях (P), сдвинутых от разрешающих до недопустимых условий при 4 hpi (S) или недопустимые условия (N). ( A–D ) Была выполнена ChIP-Seq для Pol II. Данные были сопоставлены с геномом человека (hg38) и нормализованы для образцов клеточного генома. Данные ChIP-Seq были сопоставлены с клеточными промоторами +/- 1 тыс. пар оснований от TSS. Средний сигнал для каждого условия отображается в виде линейного графика.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109.013

  Затем мы оценили, требуется ли постоянно ICP4 для истощения клеточной Pol II, а именно, остается ли ICP4 необходимым даже после начала репликации генома. Мы использовали чувствительный к температуре мутант ICP4 (tsKos), рост которого происходит при непермиссивной температуре (390,6°C) приводит к потере ICP4 в ядре (Dremel and DeLuca, 2019). Мы заразили фибробласты tsKos, выращенными в разрешительных условиях (P), сдвинутых от разрешающих к непермиссивным условиям при четырех HPI (S) или в непермиссивных условиях (N). В этой системе мы можем отделить роль ICP4 в истощении Pol II от потребности ICP4 в транскрипции E и L и репликации вирусного генома. Инфицированные клетки собирали при четырех или шести HPI и выполняли Pol II ChIP-Seq. Мы использовали недопустимые условия в качестве суррогата фиктивной инфекции, поскольку мы только что установили, что истощение Pol II не происходит при инфекции n12 (рис. 6A-B). Мы наблюдали значительное истощение Pol II из клеточных промоторов в пермиссивных и смещенных образцах (рис. 6C-D). Истощение Pol II не было напрямую связано с количеством копий вирусного генома. tsKos со сдвигом вверх имел наибольшее количество присутствующих вирусных геномов, но не достигал такого же уровня истощения клеточного Pol II, как клетки, выращенные при разрешающей температуре в течение того же периода времени. Эти данные свидетельствуют о том, что вирусный геном не несет единоличной ответственности за преимущественное привлечение клеточного Pol II. Вместо этого для удаления Pol II из клеточных промоторов требуется ICP4, связанный с вирусным геномом. Эти результаты предполагают модель, в которой репликация генома способствует истощению Pol II хозяина, когда относительное количество ICP4 к вирусным геномам высокое (2 hpi). По мере увеличения числа связанных с ICP4 вирусных геномов мы наблюдали соответствующее снижение Pol II на промоторах хозяина.

  Обсуждение

  ICP4 как приемник общих факторов транскрипции

  ICP4 синтезируется вскоре после проникновения вирусного генома в ядро ​​и остается связанным с геномом на всех этапах инфекции. Наши данные показали, что ICP4 беспорядочно связывался с вирусным геномом до репликации ДНК. В этот момент относительная концентрация ICP4 по отношению к вирусным геномам была относительно высокой, что, вероятно, способствовало мультимеризации ДНК посредством взаимодействий ICP4-ICP4 (Kuddus and DeLuca, 2007). Мы наблюдали аналогичный фенотип для партнера по взаимодействию ICP4, Mediator (Lester and DeLuca, 2011; Wagner and DeLuca, 2013). Компоненты Медиатора в основном связываются с вирусным геномом, концентрируясь вблизи вирусных ТАТА-боксов. Дополнительные взаимодействия белок-медиатор, вероятно, способствуют этому распределению. Это уникальный фенотип рекрутирования для Mediator, который связывается исключительно с клеточным TSS посредством множественных белок-белковых взаимодействий. В отсутствие ICP4 этих взаимодействий было недостаточно для поддержки связывания медиатора с вирусным геномом. За исключением рекрутирования медиатора на промоторы IE, для которого не требуется ICP4 и которое отражает активность VP16 (Batterson and Roizman, 1983; Кэмпбелл и др., 1984). Точно так же мы наблюдали от 2 до 10-кратное снижение рекрутирования Pol II, TBP и Sp1 на вирусные промоторы E и L без ICP4. Этот минимальный уровень рекрутирования недостаточен для поддержки транскрипции, что объясняет, почему только транскрипты IE эффективно транскрибируются в отсутствие ICP4.

  Зависимое от ICP4 пополнение GTF не было связано с глобальным изменением доступности. В отсутствие ICP4 вирусный геном по-прежнему не содержал гистонов и мало менялся в частоте мечения. Это, скорее всего, связано с действием ICP0, который представляет собой белок IE, экспрессируемый в отсутствие ICP4 и, как было показано, исключает гистоны из генома (Cliffe and Knipe, 2008; Ferenczy and DeLuca, 2009).). Мы утверждаем, что способность ICP4 взаимодействовать и рекрутировать Mediator и TFIID в целом в вирусный геном создает локальный градиент концентрации. В конечном итоге это увеличивает частоту рекрутирования механизма транскрипции Pol II в вирусный геном, который стабилизируется за счет контакта с дополнительными взаимодействиями белок-ДНК, белок-белок. Наше наблюдение, что ICP4 покрывает вирусный геном, уникальный фенотип рекрутирования для белка, который функционирует при рекрутировании GTF, вероятно, отражает архитектуру вирусного генома. Конденсированная организация генома HSV приводит к перекрытию вирусных промоторов и ORFS, практически без неиспользуемого кодирующего пространства. По этим причинам для ICP4 может быть выгодно обычно и динамически связываться с вирусным геномом. Также возможно, что относительно высокая плотность ICP4 в вирусном геноме до репликации ДНК может служить для репрессии транскрипции истинных поздних промоторов, которые содержат только сайты связывания для ядерных GTF. Было показано, что связывание ICP4 может в большей степени зависеть от репликации ДНК для экспрессии с относительно простых промоторов (Koop et al., 19).93; Ривера-Гонсалес и др., 1994). Эти данные продемонстрировали критическую роль ICP4 в качестве общего вирусного фактора транскрипции, необходимого для активации и продолжения транскрипции генов E и L.

  ICP4 различает вирусный и клеточный геном

  ICP4 обладает способностью связываться с двухцепочечной ДНК независимо от последовательности, чему способствует олигомеризация ICP4 в геноме. В ранние моменты времени, когда относительная концентрация ICP4 в вирусном геноме была высокой, мы наблюдали неразборчивое связывание ICP4. Этот фенотип покрытия объясняет, почему никакие специфические сайты связывания в геноме не влияют на способность ICP4 активировать транскрипцию (Coen et al., 19).86; Смайли и др., 1992). Вместо этого высокая плотность мотивов связывания ICP4 в совокупности вирусного генома создает глобальное сродство к ICP4.

  В начале инфекции мы также наблюдали связывание ICP4 с клеточными промоторами, что является новым наблюдением. ICP4 связывает промоторы генов, которые онтологически группируются с общими функциями домашнего хозяйства, включая пути, связанные с хроматином, транскрипцией и метаболизмом. Кроме того, мы обнаружили, что ICP4 специфически связывается там, где отсутствуют гистоны, рядом с эухроматическими маркерами. ICP4 не изменял хроматические маркеры промоторов, с которыми он связывался, а скорее области, связанные с ICP4, которые также были доступны в отсутствие инфекции. Это, вероятно, отражает способность ICP4 связывать обнаженную двухцепочечную ДНК независимым от последовательности способом. Этой способности способствует мультимеризация ICP4 (Kuddus and DeLuca, 2007), вероятно, поэтому мы наблюдаем связывание на ранних стадиях инфекции. GTF, присутствующие на этих клеточных промоторах, а именно комплекс TFIID и Mediator, могут дополнительно стабилизировать связывание ICP4 на этих промоторах посредством их хорошо охарактеризованных взаимодействий (Carrozza and DeLuca, 19).96; Лестер и ДеЛука, 2011 г .; Вагнер и ДеЛука, 2013).

  Последствия этого связывания для транскрипции специфических клеточных генов еще предстоит определить. Связывание ICP4 с клеточным геномом было значительно уменьшено на четыре hpi, что соответствовало 3–4 дупликациям вирусного генома. В этот момент мы также наблюдали снижение ICP4, покрывающего вирусный геном. Однако ICP4 по-прежнему обильно связывался, концентрируясь рядом с сильными родственными сайтами связывания. Скорее всего, это связано с репликацией вирусного генома, производящей больше мишеней для связывания ICP4. Простое массовое воздействие приводит к связыванию преимущественно с сайтами с более высоким сродством. Мы предполагаем, что предпочтение связывания ICP4 с вирусным геномом связано со 100-кратно более высокой плотностью родственных сайтов связывания и отсутствием клеточных гистонов.

  ICP4 как вирусный фактор транскрипции и хроматин

  Продуктивная инфекция ВПГ-1 генерирует 1000–10 000 вирусных потомков на инфицированную клетку в течение 24 часов. Чтобы облегчить этот безудержный транскрипционный сдвиг, HSV-1 манипулирует механизмом Pol II хозяина, чтобы отдать приоритет вирусным мРНК. К шести hpi вирусные мРНК составляют почти 50% от общей мРНК, присутствующей в ядре хозяина (Dremel and DeLuca, 2019). Кроме того, связывание Pol II с клеточными промоторами резко снижается при инфицировании HSV-1 (Abrisch et al., 2015; Birkenheuer et al., 2018). Недавнее исследование пришло к выводу, что компартменты вирусной репликации эффективно обогащают Pol II безмембранными доменами (McSwiggen et al., 2019).). Здесь мы идентифицировали вирусный фактор, ответственный за кооптацию механизма Pol II хозяина.

  McSwiggen et al. предположил, что это явление зависит от отсутствия нуклеосом, что делает вирусный геном в 100 раз более доступным, чем клеточный геном. Хотя мы согласны с тем, что эта доступность имеет решающее значение для вирусной инфекции, мы считаем, что она необходима для связывания ICP4. Подобно клеточному хроматину, ICP4 покрывает вирусный геном на протяжении продуктивной инфекции (рис. 7). Тем не менее, ICP4 также выполняет функцию каркаса транскрипционного механизма Pol II для вирусного генома. Мы продемонстрировали, что истощение Pol II из клеточных промоторов зависело от количества вирусных геномов, связанных с ICP4. Мы предполагаем, что один или несколько компонентов PIC, таких как партнеры по связыванию ICP4, TFIID и медиатор, являются лимитирующими, и ICP4 рекрутирует эти факторы в вирусный геном. По мере увеличения количества вирусных геномов, связанных ICP4, ограничивающие компоненты PIC больше не контактируют с клеточными промоторами. В конечном итоге это приводит к снижению занятости Pol II на промоторах хозяина, что предотвращает клеточную транскрипцию. Этот механизм необходим для облегчения быстро прогрессирующей инфекции, ограничивая при этом степень, в которой хозяин может реагировать на вирусную нагрузку.

  Модель для функции ICP4.

  ICP4 предпочтительно связывается с более доступным вирусным геномом, рекрутируя клеточные факторы транскрипции предпочтительно с вирусным геномом, тем самым активируя вирус и ингибируя клеточную транскрипцию.

  https://doi.org/10.7554/eLife.511090,014

  Материалы и методы

  Reagent type (species) or resource	Designation	Source or reference	Identifiers	Additional information
  Cell line ( Homo-sapiens )	MRC5	ATCC	ATCC CCL-171 RRID:CVCL_0440
  Cell line ( Cercopithecus aethiops)	Vero	ATCC	ATCC CCL-81 RRID:CVCL_0059
  Cell line ( Cercopithecus aethiops)	E5	DeLuca and Schaffer, 1988	E5	Клетки Vero, стабильно экспрессирующие ICP4
  Штамм, фон штамма ( Герпесвирус человека 1 )	KOS	Smith,1585
  СПАСА, Фоон штамма ( Герпесвирус человека 1 )	N12	Deluca и Schaffer, 1988	штамма KOS с Nonssense Mattation вблизи in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-in-tramemin in-in-in-in-in-in-in-in-tom. Герпесвирус человека 1 )	tsKos	Dremel and DeLuca, 2019	Штамм KOS с термочувствительным ICP4	ICP4 имеет мутацию A474V
  Antibody	Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) Mouse Monoclonal	Abcam	Cat #ab5408
  Antibody	Anti-TATA binding protein Mouse Monoclonal	Abcam	Cat #ab51841
  Antibody	Anti-Sp1 Mouse Monoclonal	Santa Cruz	Cat #sc-17824
  Antibody	Anti-Human Sur-2 (Med23) Mouse Monoclonal	BD Pharmingen	Cat #550429
  Antibody	Anti-Med1 Rabbit Polyclonal	Bethyl Laboratories	Cat #A300-793A
  Antibody	Anti-Histone h4 ( триметил K4) Мышиное моноклональное	Abcam	Cat #ab12209
  Антитело	Антитело к гистону h4 (триметил K27) Мышиное моноклональное	Abcam	Cat #ab6002
  Antibody	Anti-Histone h4 (acetyl K27) Rabbit Polyclonal	Abcam	Cat #ab4729
  Antibody	Recombinant Anti-Histone h4 (tri methyl K9) Rabbit Моноклональный	ABCAM	CAT #AB176916
  Антитела	Антиистон H4 Antibolod1574 Антитело	Анти-ICP4 (58S) Мышиное моноклональное	Neal DeLuca	Гибридомы доступны в ATCC HB-8183

  Клетки и вирусы

  Запросить подробный протокол Клетки

  Vero (почка африканской зеленой мартышки) и MRC5 (легкие плода человека) были получены и размножены в соответствии с рекомендациями ATCC. В этом исследовании использовались вирусы n12 (DeLuca and Schaffer, 1988), tsKos (Dremel and DeLuca, 2019) и КОС (Смит, 1964). Готовили запасы вируса n12 и титровали в комплементарной клеточной линии ICP4 на основе Vero, E5. Клетки E5 были получены путем стабильной трансфекции клеток Vero геном ICP4, кодируемым на pK1-2 (GenBank Nucleotide JQ407535.1). Клетки Е5 происходят из одной колонии, подтвержденной их способностью дополнять вирус n12, и вестерн-блоттинг оценивал экспрессию ICP4 (DeLuca and Schaffer, 1988). Вирусные штаммы KOS готовили и титровали в клетках Vero. Вирусные штаммы tsKos готовили и титровали в клетках Vero при разрешающей температуре (33,5°C). Все клетки регулярно проверяют на наличие микоплазменной контаминации. Клетки, используемые в этом исследовании, были свободны от микоплазмы.

  Антитела

  Использовали следующие антитела: Pol II 4H8, специфичные к фосфо S5 области повторов С-концевого домена (AbCam #ab5408), TBP (AbCam #ab51841), Sp1 (SantaCruz #sc-17824), Med23 (BD ​​Pharmingen #550429). ), Med1 (этил #A300-793A), h4K4me3 (AbCam #ab12209), h4K27me3 (AbCam #ab6002), h4K27acetyl (AbCam #ab4729), h4K9me3 (AbCam #ab176916), h4 (AbCam #1791) и ICP4 58S ( полученный из гибридомы-ATCC HB8183).

  Вирусная инфекция

  Запросить подробный протокол

  клеток MRC5 инфицировали 10 БОЕ на клетку. Вирус адсорбировали в солевом растворе с трициновым буфером (TBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Вирусный инокулят удаляли и клетки быстро промывали TBS перед добавлением 2% среды FBS. Зараженные образцы инкубировали при 37°C, если не указано иное.

  Чип-секвенирование

  Посмотреть подробный протокол

  Зараженные клетки обрабатывали 5 мл 25% формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем 5 мл 2,5 М глицина. Все следующие этапы выполняли при 4°C, если не указано иное. Культуры промывали TBS и соскребали в 50 мл FLB [5 мМ 1,4-пиперазиндиэтансульфоновой кислоты (PIPES), pH 8, 85 мМ KCl, 0,5% Igepal CA-630, 1x коктейль ингибиторов протеазы Roche]. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, ресуспендировали в 1,1 мл буфера RIPA [1x фосфатно-солевой буфер (PBS), 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия (SDS), 1x коктейль ингибиторов протеазы Roche]. Образец обрабатывали ультразвуком в течение 6 интервалов по 30 с с помощью ультразвукового устройства Sonics Vibra-Cell VCX 130, оснащенного 3-мм микрозондом, и осаждали при 2000 g в течение 15 мин. 50 мкл сохраняли в качестве входного контроля, а остаток делили поровну для использования в иммунопреципитации (ИП). 2−4 × 10 ⁷ Клетки MRC5 были применены к каждому IP. Образцы подвергали иммунопреципитации 25 мкг (TBP, Sp1) или 10 мкг (Pol II, h4K4me3, h4K27me3, h4K27ac, h4K9me3, h4) антитела. Антитело предварительно связывали с 50 мкл гранул Dynabeads M280 с овечьим антимышиным IgG или с овечьим антикроличьим IgG Dynabeads M280 в 5% бычьем сывороточном альбумине (BSA) 1x PBS в течение ночи. Образцы ДНК связывали с комплексом антитело-гранулы в течение ночи, вращая. Смеси IP промывали семь раз промывочным буфером LiCl [буфер Tris-HCl 100 мМ pH 7,5, 500 мМ LiCl, 1% Igepal CA-630, 1% дезоксихолат натрия] и один раз буфером Tris-EDTA (TE). Гранулы ресуспендировали в элюирующем буфере IP [1% SDS, 0,1 М NaHCO ₃ ] и инкубировали при 65°С в течение 2 часов при 900 об/мин. Входную аликвоту суспендировали в буфере для элюции IP. Вводимые и ИП образцы инкубировали при 65°С при 900 об/мин в течение ночи. Образцы экстрагировали смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), а затем очищали с использованием колонок Qiagen PCR cleanup. Каждый образец был количественно определен с использованием флуорометра Qubit 2.0 (Invitrogen), и 2–20 нг были использованы для создания библиотек секвенирования с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra II (NEB #E7103S). Библиотеки количественно определяли с использованием набора Agilent DNA 7500 Kit, и образцы смешивали вместе в эквимолярной концентрации. Одностороннее секвенирование Illumina HiSeq 2500 из 50 пар оснований было проведено в Центральном центре Университета Тафтса.

  ATAC-секвенирование

  Запросить подробный протокол

  Мы адаптировали протокол Buenrostro et al. (2013). Вкратце, 2 миллиона клеток MRC5 помещали в чашки диаметром 60 мм и оставляли расти в течение ночи. Клетки инфицировали, как описано выше. Неинфицированные и инфицированные n12 клетки собирали при 4 HPI. Клетки, инфицированные WT HSV-1, собирали перед репликацией при двух HPI. Зараженные образцы однократно промывали охлажденным TBS и буфером для лизиса-1 [10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl ₂ ]. Образцы инкубировали с 2 мл буфера для лизиса-2 [10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl ₂ , 0,1% Igepal CA-630] в течение 3 мин на льду. Клетки осторожно ресуспендировали и перемешивали до тех пор, пока ядра не становились видимыми при окрашивании трипановым синим. Ядра центрифугировали при 500 g в течение 10 мин при 4°C и ресуспендировали в буфере для лизиса-1. 250 мкл (5 × 10 ⁵ клеток) переносили в пробирку эпиндорфа и центрифицировали при 500 g в течение 10 мин при 4°C. Ядра ресуспендировали в 22 мкл буфера TD (каталожный номер Illumina 15027866), 2,5 мкл TDE1 (каталожный номер Illumina 15027865) и 22,5 мкл воды и инкубировали при 37°C в течение 30 мин при осторожном встряхивании. ДНК очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR (Qiagen Cat No./ID: 28004). Всего ПЦР-амплификацию проводили в течение 8–14 циклов. Библиотеки количественно определяли с использованием набора Agilent DNA 7500 Kit, и образцы смешивали вместе в эквимолярной концентрации. Секвенирование проводилось в Центральном центре Университета Тафтса, одностороннее секвенирование Illumina HiSeq 2500 из 50 п.н. выполнялось для повтора 1, Illumina Mid-Output NextSeq выполнялось для повторов 2 и 3.

  Анализ данных

  чип-Seq

  Запросить подробный протокол

  Данные были загружены на веб-платформу Galaxy, и мы использовали общедоступный сервер usegalaxy. org для анализа данных (Afgan et al., 2018). Сначала данные были сопоставлены с использованием Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012) с геномом человека (hg38), а затем невыровненные чтения были сопоставлены с геномом KOS штамма HSV-1 (KT899744.1). Файлы Bam были визуализированы с использованием bamcoverage DeepTools (Ramirez et al., 2016) с размером ячейки 1 для создания больших файлов. Данные просматривались в программе просмотра IGV и экспортировались в виде файлов EPS. Файлы Bigwig были нормализованы по глубине секвенирования и количеству генома. Сопоставленные чтения умножались на «коэффициент нормы», который рассчитывался как обратное соотношение (Inputcellularreads)/(Inputcellular+viralmappedreads(TMR))×BillionssampleTMR или (Inputviralreads)/TMR×MillionssampleTMR. Эксперименты ChIP-Seq повторяли в общей сложности от 2 до 4 биологических повторов. Нормализованные большие файлы были усреднены между репликами. Тепловые карты и профили генов были созданы с использованием MultiBigwigSummary (Ramirez et al. , 2016) на нормализованных клеточных файлах bigwig для всех мРНК, аннотированных UCSC. Профили генов и тепловые карты были построены с использованием plotProfile и plotHeatmap (Ramirez et al., 2016). Корреляционный анализ Спирмена был выполнен с использованием программы Deeptools plotCorrelation на multiBigwigSummary, ограниченной клеточными транскриптами (Ramirez et al., 2016).

  Пиковый вызов

  Запросить подробный протокол

  вирусных пиков были вызваны с использованием пика вызова MACS2 (Feng et al., 2012), объединяя файлы лечения и контроля для каждого состояния. Из-за небольшого размера вирусного генома (151974 п.н.) мы не могли использовать вариант смещающейся модели (—nomodel). Чтобы компенсировать плотное связывание ICP4, мы использовали фиксированную фоновую лямбду в качестве локальной лямбды для каждой области пика и более сложный подход к обработке сигналов для поиска вершин подпиков в каждой обогащенной области пиков (—call-summits).

  Клеточные пики были вызваны с использованием MACS2 (Feng et al. , 2012). Сначала мы удалили неуникально сопоставленные последовательности с помощью SAMtools, отфильтровали SAM или BAM для минимального показателя качества MAPQ, равного 20 (Li et al., 2009). Мы определили приблизительный размер расширения для каждого IP-адреса, используя прогноз MACS2 и усреднив оценку размера между повторами. Мы запустили пик вызовов MACS2 для отдельных повторов и объединенных образцов без модели сдвига (—nomodel). Чтобы определить пики с высокой достоверностью, присутствующие в каждом выходе MACS2, мы использовали Galaxy Operate on Genomic Intervals, Join. Пересечение пиков было проанализировано на предмет размера пересечения и статистики жаккарда с использованием JaccardBed (Ramirez et al., 2016). ChIPseeker был запущен на выходных данных MACS2 для оценки клеточных областей, связанных в каждом состоянии (Yu et al., 2015).

  Открытие мотива

  Запросить подробный протокол

  Bedtools Multiple Intersect (Quinlan and Hall, 2010) использовали для сравнения выходных данных MACS2 для ICP4 IP через 2, 4 и 6 часов. Файл BED был создан для областей +/- 100 п.н. от вершин каждого идентифицированного пика. Пики, общие для всех трех экспериментальных условий, использовались для создания файла fasta с помощью GetFastaBed (Quinlan and Hall, 2010). Пики, присутствующие во всех трех временных точках, были отправлены в MEME v.4.11.1.0 для анализа мотивов (Bailey et al., 2009).). Консенсусная последовательность на рисунке 1 имела наиболее значимое значение E и была единственным мотивом, обнаруженным более чем в пяти пиках.

  Корреляционный анализ

  Запросить подробный протокол

  Чтобы оценить качество и воспроизводимость данных, мы оценили нормализованные файлы bigwig для каждой реплики IP. Для выравнивания клеток и вирусов мы использовали MultiBigwigSummary (Ramirez et al., 2016) с размером ячейки 10 000 и 50 п.н. соответственно. Были нанесены на график необработанные количества бункеров и проведен линейный регрессионный анализ (рис. 3 — дополнения к рисунку 1–2).

  ATAC-Seq

  Посмотреть подробный протокол

  Сначала данные были сопоставлены с использованием Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012) с геномом человека (hg38), а затем невыровненные чтения были сопоставлены с геномом KOS штамма HSV-1 (KT899744. 1) со следующими параметрами: –no-unal –локальные –очень чувствительные-локальные –недискордантные –не смешанные –содержат –перекрываются –ласточкин хвост –phred33. Приблизительный размер фрагмента для парных данных чтения концов определяли из сопоставленных файлов bam с использованием CollectInsertSizeMetrics (Broad Institute, Picard). Файлы Bam были визуализированы с использованием bamcoverage DeepTools (Ramirez et al., 2016) с размером ячейки 1 для создания больших файлов. Данные просматривались в программе просмотра IGV и экспортировались в виде файлов EPS. Файлы сотовых больших парней были нормализованы для глубины секвенирования, значения по оси Y отображают количество прочтений на миллиард общих прочтений. Файлы вирусных шишек были дополнительно нормализованы по количеству копий вирусного генома, см. Таблицу 3C. Значения по оси Y представляют собой сопоставленные считывания на миллиард общих чтений на число копий вирусного генома. Нормализованные большие файлы были усреднены между тремя биологическими повторами. Тепловые карты и профили генов были созданы с использованием MultiBigwigSummary (Ramirez et al., 2016) на нормализованных клеточных файлах bigwig для всех мРНК, аннотированных UCSC. Профили генов и тепловые карты были построены с использованием plotProfile и plotHeatmap (Ramirez et al., 2016). Чтобы рассчитать процент общей ДНК, соответствующей вирусу или хозяину при инфекции n12 и WT HSV-1, мы использовали входные чтения ChIP-Seq. Мы рассчитали средний процент от общего числа прочтений, которые соответствовали вирусу или хозяину, в четырех образцах ChIP-Seq биологической репликации. Мы использовали это значение для расчета количества вирусных геномов, содержащихся в каждом ядре. Это значение использовалось для определения наблюдаемого обогащения тегами по отношению к фактическому количеству присутствующего содержимого генома.

  Доступность данных

  Все данные общедоступны в базе данных SRA (PRJNA553543, PRJNA553555, PRJNA553559, PRJNA553563, PRJNA508791).

  Были сгенерированы следующие наборы данных

  1. 1. Сара Э Дремел
     2. Нил ДеЛука

     (2019) Архив чтения последовательности

     ID PRJNA553563. ICP4 ChIP-Seq продуктивной инфекции WT (KOS) HSV-1 в клетках MRC5.

     https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA553563

  2. 1. Сара Дремел
     2. Нил ДеЛука

     (2019) Архив чтения последовательности

     ID PRJNA553559. ATAC-Seq WT (KOS) и ICP4 null (n12) Продуктивная инфекция HSV-1 в клетках MRC5.

     https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA553559

  3. 1. Сара Дремел
     2. Нил ДеЛука

     (2019) Архив чтения последовательности

     ID PRJNA553555. GTF ChIP-Seq WT (KOS) и ICP4 null (n12) Продуктивная инфекция HSV-1 в клетках MRC5.

     https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA553555

  4. 1. Сара Э Дремел
     2. Нил ДеЛука

     (2019) Архив чтения последовательности

     ID PRJNA553543. Histone ChIP-Seq WT (KOS) и ICP4 null (n12) Продуктивная инфекция HSV-1 в клетках MRC5.

     https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA553543

  Были использованы следующие ранее опубликованные наборы данных

  1. 1. Сара Э Дремел
     2. Нил ДеЛука

     (2019) Архив чтения последовательности

     ID PRJNA508791. ChIP-Seq продуктивной инфекции HSV-1 (tsKos).

     https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA508791

  Каталожные номера

  1. 1. Абриш RG
     2. Эйдем ТМ
     3. Яковчук П
     4. Кугель JF
     5. Гудрич JA

     (2015) Инфекция вирусом простого герпеса 1 вызывает почти полную потерю присутствия РНК-полимеразы II в геноме клетки-хозяина

     Journal of Virology 90 :2503–2513.

     https://doi.org/10.1128/JVI.02665-15

     • пабмед
     • Google ученый
  2. 1. Афган E
     2. Бейкер Д
     3. Батут Б
     4. ван ден Бик М
     5. Бувье D
     6. Чех М
     7. Чилтон Дж
     8. Клементс Д
     9. Кораор N
     10. Грюнинг BA
     11. Герлер А
     12. Хиллман-Джексон J
     13. Хильтеманн S
     14. Джалили В
     15. Раше H
     16. Соранцо N
     17. Гекс J
     18. Тейлор Дж
     19. Некрутенко А
     20. Бланкенберг D

     (2018) Платформа Galaxy для доступных, воспроизводимых и совместных биомедицинских анализов: обновление 2018 г.

     Nucleic Acids Research 46 :W537–W544.

     https://doi.org/10.1093/нар/gky379

     • пабмед
     • Google ученый
  3. 1. Алвин JC
     2. Стейнхарт WL
     3. Хилл CW

     (1974) Транскрипция ДНК герпеса простого типа 1 в ядрах, выделенных из инфицированных клеток HEp-2 и KB

     Вирусология 60 :302–307.

     https://doi.org/10.1016/0042-6822(74)

     -0

     • пабмед
     • Google ученый
  4. 1. Бейли TL
     2. Боден М
     3. Буске FA
     4. Фрит М
     5. Грант CE
     6. Клементи Л
     7. Рен Дж
     8. Ли WW
     9. Благородный WS

     (2009) MEME SUITE: инструменты для обнаружения и поиска мотивов

     Nucleic Acids Research 37 :W202–W208.

     https://doi.org/10.1093/нар/гкп335

     • пабмед
     • Google ученый
  5. 1. Баттерсон W
     2. Ройзман Б

     (1983)

     Характеристика фактора, ассоциированного с вирионом простого герпеса, ответственного за индукцию альфа-генов

     Journal of Virology 46 :371–377.

     • пабмед
     • Google ученый
  6. 1. Биркенхойер CH
     2. Данко CG
     3. Бейнс JD

     (2018) Вирус простого герпеса 1 резко изменяет загрузку и расположение РНК-полимеразы II в генах хозяина на ранних стадиях инфекции

     Журнал вирусологии 92 :e02184-17.

     https://doi.org/10.1128/JVI.02184-17

     • пабмед
     • Google ученый
  7. 1. Буэнростро JD
     2. Гиреси PG
     3. Заба LC
     4. Чанг HY
     5. Гринлиф WJ

     (2013) Транспозиция нативного хроматина для быстрого и чувствительного эпигеномного профилирования открытого хроматина, ДНК-связывающих белков и положения нуклеосом

     Nature Methods 10 :1213–1218.

     https://doi.org/10.1038/nmeth.2688

     • пабмед
     • Google ученый
  8. 1. Кэмпбелл ME
     2. Палфриман JW
     3. Престон см

     (1984) Идентификация последовательностей ДНК вируса простого герпеса, которые кодируют транс-действующий полипептид, ответственный за стимуляцию непосредственной ранней транскрипции

     Журнал молекулярной биологии 180 :1–19.

     https://doi.org/10.1016/0022-2836(84)-3

     • пабмед
     • Google ученый
  9. 1. Карроцца MJ
     2. ДеЛука Н.А.

     (1996) Взаимодействие белка вирусного активатора ICP4 с TFIID через TAF250

     Молекулярная и клеточная биология 16 :3085–3093.

     https://doi.org/10.1128/MCB.16.6.3085

     • пабмед
     • Google ученый
  10. 1. Клифф AR
      2. Нож DM

      (2008) Вирус простого герпеса ICP0 способствует как удалению гистонов, так и ацетилированию вирусной ДНК во время литической инфекции

      Журнал вирусологии 82 :12030–12038.

      https://doi.org/10.1128/JVI.01575-08

      • пабмед
      • Google ученый
  11. 1. Коэн DM
      2. Вайнхаймер СП
      3. Макнайт SL

      (1986) Генетический подход к распознаванию промотора во время трансиндукции экспрессии вирусного гена

      Наука 234 :53–59.

      https://doi.org/10.1126/science.3018926

      • пабмед
      • Google ученый
  12. 1. Кортни Р.Дж.
      2. Бенеш-Мельник М

      (1974) Выделение и характеристика крупномолекулярного полипептида вируса простого герпеса типа 1

      Вирусология 62 :539–551.

      https://doi.org/10.1016/0042-6822(74)

      -0

      • пабмед
      • Google ученый
  13. 1. ДеЛука Н.А.
      2. Маккарти AM
      3. Шаффер PA

      (1985)

      Выделение и характеристика делеционных мутантов вируса простого герпеса типа 1 в гене, кодирующем немедленно-ранний регуляторный белок ICP4

      Journal of Virology 56 :558–570.

      • пабмед
      • Google ученый
  14. 1. ДеЛука Н.А.
      2. Шаффер PA

      (1988)

      Физические и функциональные домены регуляторного белка транскрипции вируса простого герпеса ICP4

      Journal of Virology 62 :732–743.

      • пабмед
      • Google ученый
  15. 1. Дембовски JA
      2. ДеЛука Н.А.

      (2015) Селективное привлечение ядерных факторов к продуктивно реплицирующимся геномам вируса простого герпеса

      PLOS Патогены 11 :e1004939.

      https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004939

      • пабмед
      • Google ученый
  16. 1. Дембовски JA
      2. ДеЛука Н.А.

      (2018) Временные взаимодействия вирусного генома и белка определяют отдельные стадии продуктивной герпесвирусной инфекции

      mBio 9 :e01182-18.

      https://doi.org/10.1128/mBio.01182-18

      • пабмед
      • Google ученый
  17. 1. ДиДонато JA
      2. Шпицнер JR
      3. Мюллер МТ

      (1991) Прогностическая модель распознавания ДНК белком вируса простого герпеса ICP4

      Journal of Molecular Biology 219 : 451–470.

      https://doi.org/10.1016/0022-2836(91)

  -A
  • пабмед
  • Google ученый
  18. 1. Диксон РА
      2. Шаффер PA

      (1980)

      Картирование тонкой структуры и функциональный анализ чувствительных к температуре мутантов в гене, кодирующем белок VP175 вируса простого герпеса типа 1, непосредственно ранний белок VP175

      Journal of Virology 36 :189.

      • пабмед
      • Google ученый
  19. 1. Дремел SE
      2. ДеЛука Н.А.

      (2019) Репликация генома влияет на связывание факторов транскрипции, опосредуя каскад транскрипции вируса простого герпеса

      PNAS 116 :3734–3739.

      https://doi.org/10.1073/pnas.1818463116

      • пабмед
      • Google ученый
  20. 1. Эверетт РД
      2. Сурвинос G
      3. Орр А

      (2003) Рекрутирование белка ICP4, регулирующего транскрипцию вируса простого герпеса типа 1, в очаги рядом с ND10 в живых инфицированных клетках

      Journal of Virology 77 :3680–3689.

      https://doi.org/10.1128/JVI.77.6.3680-3689.2003

      • пабмед
      • Google ученый
  21. 1. Фабер SW
      2. Уилкокс КВ

      (1986) Ассоциация регуляторного белка ICP4 вируса простого герпеса со специфическими последовательностями нуклеотидов в ДНК

      Исследование нуклеиновых кислот 14 :6067–6083.

      https://doi.org/10.1093/nar/14.15.6067

      • пабмед
      • Google ученый
  22. 1. Фэн Дж
      2. Лю Т
      3. Цинь Б
      4. Чжан И
      5. Лю XS

      (2012) Идентификация обогащения ChIP-seq с использованием MACS

      Nature Protocols 7 :1728–1740.

      https://doi.org/10.1038/nprot.2012.101

      • пабмед
      • Google ученый
  23. 1. Ференци MW
      2. ДеЛука Н.А.

      (2009) Эпигенетическая модуляция экспрессии генов из покоящихся геномов вируса простого герпеса

      Journal of Virology 83 :8514–8524.

      https://doi.org/10.1128/JVI.00785-09

      • пабмед
      • Google ученый
  24. 1. Честность РВ
      2. Ройзман Б

      (1974а)

      Регуляция макромолекулярного синтеза вируса герпеса

      Journal of Virology 14 :8–19.

      • пабмед
      • Google ученый
  25. 1. Честность РВ
      2. Ройзман Б

      (1974б)

      Регуляция макромолекулярного синтеза вируса герпеса. I. каскадная регуляция синтеза трех групп вирусных белков

      Journal of Virology 14 :8–19.

      • пабмед
      • Google ученый
  26. 1. Честность РВ
      2. Ройзман Б

      (1975) Регуляция макромолекулярного синтеза герпесвируса: для последовательного перехода синтеза полипептидов необходимы функциональные вирусные полипептиды

      PNAS 72 :1276–1280.

      https://doi.org/10.1073/pnas.72.4.1276

      • Google ученый
  27. 1. Имбальцано AN
      2. Коэн DM
      3. ДеЛука Н.А.

      (1991)

      Трансактиватор вируса простого герпеса ICP4 оперативно заменяет клеточный фактор транскрипции Sp1 для эффективной экспрессии гена вирусной тимидинкиназы

      Journal of Virology 65 :565–574.

      • пабмед
      • Google ученый
  28. 1. Нож DM
      2. Клифф А

      (2008) Контроль хроматина литической и латентной инфекции вируса простого герпеса

      Nature Reviews Microbiology 6 : 211–221.

      https://doi.org/10.1038/nrmicro1794

      • пабмед
      • Google ученый
  29. 1. Куп КЕ
      2. Дункан Дж
      3. Смайли младший

      (1993)

      Сайты связывания белка ICP4 вируса простого герпеса непосредственно-раннего возраста обуславливают повышенную зависимость репликации вирусной ДНК от промоторов простой модели, расположенных в вирусном геноме

      Journal of Virology 67 :7254–7263.

      • пабмед
      • Google ученый
  30. 1. Куддус РХ
      2. ДеЛука Н. А.

      (2007) ДНК-зависимая олигомеризация регуляторного белка вируса простого герпеса типа 1 ICP4

      Journal of Virology 81 :9230–9237.

      https://doi.org/10.1128/JVI.01054-07

      • пабмед
      • Google ученый
  31. 1. Лэнгмид Б
      2. Зальцберг SL

      (2012) Быстрое выравнивание с промежутками считывания с помощью галстука-бабочки 2

      Nature Methods 9 :357–359.

      https://doi.org/10.1038/nmeth.1923

      • Google ученый
  32. 1. Лестер JT
      2. ДеЛука Н. А.

      (2011) Вирус простого герпеса 1 ICP4 образует комплексы с TFIID и медиатором в инфицированных вирусом клетках

      Journal of Virology 85 :5733–5744.

      https://doi.org/10.1128/JVI.00385-11

      • пабмед
      • Google ученый
  33. 1. Ли Х
      2. Хэндсейкер B
      3. Высокер А
      4. Феннелл Т
      5. Руан Дж
      6. Гомер N
      7. Март Г
      8. Абеказис G
      9. Дурбин Р
      10. Подгруппа обработки данных проекта 1000 Genome

      (2009) Выравнивание последовательностей/формат карты и SAMtools

      Биоинформатика 25 :2078–2079.

      https://doi.org/10.1093/биоинформатика/btp352

      • пабмед
      • Google ученый
  34. 1. Лян И
      2. Фогель JL
      3. Нараянан А
      4. Пэн Х
      5. Кристи ТМ

      (2009) Ингибирование гистондеметилазы LSD1 блокирует литическую репликацию и реактивацию α-герпесвируса с латентного периода

      Природная медицина 15 :1312–1317.

      https://doi.org/10.1038/nm.2051

      • Google ученый
  35. 1. МакГеоч DJ
      2. Долан А
      3. Дональд С
      4. Риксон FJ

      (1985) Определение последовательности и генетического содержания короткой уникальной области в геноме вируса простого герпеса типа 1

      Journal of Molecular Biology 181 :1–13.

      https://doi.org/10.1016/0022-2836(85)-1

      • пабмед
      • Google ученый
  36. 1. МакГеоч DJ
      2. Долан А
      3. Дональд С
      4. Брауэр DH

      (1986) Полная последовательность ДНК области коротких повторов в геноме вируса простого герпеса типа 1

      Nucleic Acids Research 14 :1727–1745.

      https://doi.org/10.1093/nar/14.4.1727

      • пабмед
      • Google ученый
  37. 1. МакГеоч DJ
      2. Далримпл MA
      3. Дэвисон AJ
      4. Долан А
      5. Рама МС
      6. Макнаб D
      7. Перри ЖЖ
      8. Скотт JE
      9. Тейлор П

      (1988) Полная последовательность ДНК длинной уникальной области в геноме вируса простого герпеса типа 1

      Journal of General Virology 69 :1531–1574.

      https://doi.org/10.1099/0022-1317-69-7-1531

      • пабмед
      • Google ученый
  38. 1. Максвигген DT
      2. Хансен AS
      3. Тевес СС
      4. Мари-Нелли H
      5. Хао Y
      6. Хекерт AB
      7. Умемото КК
      8. Дугаст-Дарзак C
      9. Тиан Р
      10. Дарзак X

      (2019) Доказательства ДНК-опосредованной ядерной компартментализации, отличной от фазового разделения

      eLife 8 :e47098.

      https://doi.org/10.7554/eLife.47098

      • пабмед
      • Google ученый
  39. 1. Пауэлл КЛ
      2. Пурифой DJ

      (1976) ДНК-связывающие белки клеток, инфицированных вирусом простого герпеса 1 и 2 типа

      Интервирусология 7 :225–239.

      https://doi.org/10.1159/000149955

      • пабмед
      • Google ученый
  40. 1. Престон см

      (1979)

      Контроль синтеза мРНК вируса простого герпеса 1 типа в клетках, инфицированных вирусом дикого типа или термочувствительным мутантом tsK

      Journal of Virology 29 :275–284.

      • пабмед
      • Google ученый
  41. 1. Престон см
      2. Рама МС
      3. Кэмпбелл ME

      (1988) Комплекс, образованный между клеточными компонентами и структурным полипептидом ВПГ, связывается с последовательностью ДНК, регулирующей непосредственно ранний ген вируса

      Сотовый 52 :425–434.

      https://doi.org/10.1016/S0092-8674(88)80035-7

      • пабмед
      • Google ученый
  42. 1. Куинлан AR
      2. Зал ИМ

      (2010) BEDTools: гибкий набор утилит для сравнения геномных признаков

      Биоинформатика 26 :841–842.

      https://doi.org/10.1093/биоинформатика/btq033

      • пабмед
      • Google ученый
  43. 1. Рамирес Ф
      2. Райан ДП
      3. Грюнинг Б
      4. Бхардвадж В
      5. Килперт Ф
      6. Рихтер AS
      7. Хейн S
      8. Дюндар F
      9. Манке Т

      (2016) deepTools2: веб-сервер нового поколения для глубокого анализа данных

      Nucleic Acids Research 44 :W160–W165.

      https://doi. org/10.1093/nar/gkw257

      • пабмед
      • Google ученый
  44. 1. Ривера-Гонсалес R
      2. Имбальцано AN
      3. Гу Б
      4. Делука Н.А.

      (1994) Роль репрессорной активности ICP4 во временной экспрессии промоторов транскриптов IE-3 и связанных с латентностью во время инфекции HSV-1

      Вирусология 202 :550–564.

      https://doi.org/10.1006/viro.1994.1377

      • пабмед
      • Google ученый
  45. 1. Сампат П
      2. Делука Н. А.

      (2008) Связывание ICP4, ТАТА-связывающего белка и РНК-полимеразы II с немедленным ранним, ранним и поздним промотором вируса простого герпеса типа 1 в инфицированных вирусом клетках

      Journal of Virology 82 :2339–2349

      https://doi.org/10.1128/JVI.02459-07

      • пабмед
      • Google ученый
  46. 1. Смайли младший
      2. Джонсон, округ Колумбия,
      3. Пайзер ЛИ
      4. Эверетт РД

      (1992)

      Сайты связывания ICP4 в промоторе гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса типа 1 не важны для эффективной транскрипции gD во время вирусной инфекции

      Journal of Virology 66 :623–631.

      • пабмед
      • Google ученый
  47. 1. Смит KO

      (1964) Связь между оболочкой и инфекционностью вируса простого герпеса

      Экспериментальная биология и медицина 115 :814–816.

      https://doi.org/10.3181/00379727-115-29045

      • Google ученый
  48. 1. Стерн S
      2. Танака М
      3. Герр W

      (1989) Гомеодомен Oct-1 направляет образование мультибелково-ДНК комплекса с трансактиватором HSV VP16

      Природа 341 :624–630.

      https://doi.org/10.1038/341624a0

      • пабмед
      • Google ученый
  49. 1. Стерн S
      2. Герр W

      (1991) Транс-активатор вируса простого герпеса VP16 распознает гомео-домен Oct-1: свидетельство субдомена распознавания гомео-домена

      Гены и развитие 5 :2555–2566.

      https://doi.org/10.1101/gad.5.12b.2555

      • пабмед
      • Google ученый
  50. 1. Вагнер ЛМ
      2. ДеЛука Н.А.

      (2013) Временная ассоциация вируса простого герпеса ICP4 с клеточными комплексами, функционирующими на нескольких этапах транскрипции PolII

      PLOS ONE 8 :e78242.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078242

      • пабмед
      • Google ученый
  51. 1. Уотсон РДЖ
      2. Клементс JB

      (1980) Функция вируса простого герпеса типа 1 постоянно необходима для раннего и позднего синтеза вирусной РНК

      Природа 285 :329–330.

      https://doi.org/10.1038/285329a0

      • пабмед
      • Google ученый
  52. 1. Яо Ф
      2. Кортни RJ

      (1989)

      Основной белок, регулирующий транскрипцию (ICP4) вируса простого герпеса типа 1, связан с очищенными вирионами

      Journal of Virology 63 :3338–3344.

      • пабмед
      • Google ученый
  53. 1. Ю Г
      2. Ван LG
      3. Он QY

      (2015) ChIPseeker: пакет R/Bioconductor для аннотации, сравнения и визуализации пиков ChIP

      Биоинформатика 31 :2382–2383.

      https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv145

      • пабмед
      • Google ученый

  Письмо-решение

  Благодарим вас за представление статьи «Нуклеопротеин простого герпеса создает конкурентную среду, способствующую надежной транскрипции вируса и отключению хозяина» на рассмотрение eLife . Ваша статья была рассмотрена тремя рецензентами, один из которых является членом нашего Совета редакторов-рецензентов, а за оценкой наблюдала Джессика Тайлер в качестве старшего редактора. Следующее лицо, участвовавшее в рассмотрении вашей заявки, согласилось раскрыть свою личность: Ларс Дёлькен (Рецензент №2).

  Рецензенты обсудили обзоры друг с другом, и редактор-рецензент подготовил это решение, чтобы помочь вам подготовить исправленное представление.

  Резюме:

  В рукописи описывается, как белок ICP4 ВПГ-1 играет ключевую роль в перепрограммировании клеточного механизма транскрипции Pol II. Авторы показывают, что ICP4 предпочтительно связывается с вирусным геномом и образует вирусный нуклеопротеин, который затем предпочтительно рекрутирует факторы транскрипции Pol II в вирусный геном, эффективно вызывая отключение хозяина. По-видимому, ICP4 выгодно связывается с поступающей голой вирусной ДНК на ранних этапах заражения. В целом, статья описывает новое и важное свойство белка ICP4 в жизненном цикле ВПГ. Однако рецензенты подняли ряд вопросов, которые следует рассмотреть в пересмотренном представлении.

  Существенные изменения:

  1) У нулевых мутантов ICP4 все еще можно наблюдать относительно высокий охват считывания для связывания ICP4 (например, рисунок 2 — дополнение к рисунку 1 и другие). Как авторы объясняют этот паттерн для нулевого мутанта ICP4, у которого не должно наблюдаться связывания ICP4? Если такое покрытие представляет собой неспецифический фон, авторы должны явно указать, были ли фоновые чтения вычтены из графиков покрытия связывания ICP4 на всех рисунках?

  2) Основной вывод авторов заключается в том, что ICP4 не только связывает специфический мотив вирусных промоторов E на ранних стадиях инфекции, но и беспорядочно связывает поступающую вирусную ДНК. Хотя количественный анализ убедительно подтверждает их гипотезу, следует рассмотреть и более тщательно обсудить другие объяснения и, в частности, последствия их открытия. Следует отметить, что влияние ICP4 на доступность вирусного генома было довольно небольшим (в 2,8 раза по сравнению с 4-кратным). В чем преимущество вируса, рекрутирующего ICP4 независимым от последовательности способом в вирусный геном? Как это способствует различиям в промоторах E и L? Авторам следует расширить свое обсуждение этого вопроса.

  3) Авторы заявляют, что связывание ICP4 с клеточным геномом ограничивается доступными областями клеточного генома, а именно промоторными областями. Однако хорошо известно, что ICP4 связывается с медиатором, который демонстрирует ту же картину распределения, что и ICP4, в клеточных генах на ранних стадиях инфекции, как и ICP4. Поскольку специфические мотивы связывания ICP4 не объясняют связывание ICP4 с клеточными промоторными областями, альтернативное объяснение состоит в том, что ICP4 рекрутируется в клеточные промоторные области посредством его взаимодействия с Mediator (а не благодаря его ДНК-связывающей активности). ATAC-seq также выявляет участки генома, которые становятся «доступными» независимо от медиатора. Авторы должны проверить совместную локализацию прочтений ICP4 с пиками ATAC-seq за пределами промоторных областей (без перекрывающихся прочтений Mediator).

  4) В разделе «Антитела» раздела «Материалы и методы» должно быть указано, что антитело Pol II специфично в отношении фосфорилированных остатков серина 5 CTD. Как правило, следует избегать использования клона 4H8 антитела Pol II в качестве показателя общей занятости pol II. Хотя этот клон обычно используется для измерения общей занятости pol II, фосфо-серин 5 обогащен по сравнению с общим pol II в промоторах и сайтах сплайсинга. Это предубеждение, во всяком случае, было полезным для авторов, поскольку они больше всего сосредоточились на промоторах, хотя это может помешать более глубокому анализу в будущем в отношении других этапов транскрипции или экспериментальных условий, в которых фосфорилирование серина 5 изменено. . Таким образом, важно, чтобы это смещение (заявленное на веб-сайте производителя) сразу бросалось в глаза читателю.

  5) Авторы адаптировали шкалу оси Y на ряде рисунков, чтобы обеспечить лучшую визуализацию своих данных. Хотя это было сделано хорошо для большинства рисунков, некоторые корректировки масштаба затрудняют сравнение результатов. Например, на рис. 2В авторы показывают занятость polII, а также ТВР. на двух выбранных вирусных генах. К сожалению, ось Y резко различается между панелями, что очень затрудняет сравнение (например, Sp1 32 312 против 11 877). Эти различия также затрудняют сравнение мутантного n12 и вируса дикого типа на рис. 3 — дополнение к рисунку 3. Авторам следует стандартизировать шкалы по оси Y, чтобы можно было сравнивать панели и избегать ошибочных интерпретаций.

  6) Подраздел «ICP4 как фактор транскрипции вируса и как хроматин»: в настоящее время неясно, происходит ли рекрутирование основных факторов транскрипции IE во входящие вирусные геномы только при инфекции HSV или также при других герпесвирусах, например, ЦМВ-инфекция. Поэтому в настоящее время нет доказательств того, что это объясняет различия в кинетике литической репликации между разными герпесвирусами. Интересно, что относительный вклад экспрессии вирусных генов в течение первых 2 часов инфекции MCMV даже выше, чем наблюдаемый для HSV-1. Однако репликация ДНК MCMV не начинается до 12 ч p.i. тогда как он инициируется уже через 2 ч p.i. при инфекции ВПГ-1. Двух часов лечения интерфероном недостаточно, чтобы вызвать сильное защитное противовирусное состояние. Таким образом, реакция хозяина вряд ли предотвратит репликацию вирусной ДНК при инфекции MCMV, которая уже начинается через 2 ч после заражения. В совокупности это является сильным аргументом против важной роли рекрутирования ICP4 в вирусные геномы в объяснении различий в кинетике репликации между различными герпесвирусами. Принимая во внимание консервативный каскад экспрессии генов IE, E, L, можно предположить, что покрытие входящих вирусных геномов основным вирусным трансактиватором является консервативной особенностью герпесвирусов.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109.027

  Ответ автора

  Основные версии:

  1) У нулевых мутантов ICP4 все еще можно наблюдать относительно высокий охват считывания для связывания ICP4 (например, рисунок 2 — дополнение к рисунку 1 и др. ). Как авторы объясняют этот паттерн для нулевого мутанта ICP4, у которого не должно наблюдаться связывания ICP4?

  ICP4 упаковывается в вирусный тегумент и, таким образом, проникает в клетку с заражающим вирионом. Чтобы получить запасы нулевого вируса ICP4, мы должны вырастить вирус в дополнительных клетках, которые продуцируют ICP4. Таким образом, n12 все еще имеет ICP4, упакованный в вирионы, но не продуцирует зарождающийся ICP4 во время инфекции. Мы не можем сказать, связаны ли считывания, которые мы видим с ICP4 ChIP-seq инфекции n12, из-за входящего тегумента ICP4, связывающего вирусный геном, или ICP4 приносит фрагменты вирусного генома в тегумент во время продукции вириона в комплементарных клетках. Чтобы разъяснить этот факт читателям, мы добавили в текст следующее:

  «Было относительно небольшое количество прочтений в ICP4 ChIP n12 (рис. 2A, рис. 2 — дополнение к рисунку 1). […] Хотя окончательный источник этих прочтений в настоящее время не ясен, степень связывания ICP4 из вириона с ДНК недостаточна для стимулирования транскрипционных комплексов на ранних и поздних вирусных генах».

  Если такое покрытие представляет собой неспецифический фон, авторы должны явно указать, были ли фоновые чтения вычтены из графиков покрытия связывания ICP4 на всех рисунках?

  Мы не вычитали входные или фоновые чтения ни из каких наших данных ChIP-seq. Данные были умножены на установленный коэффициент, чтобы скорректировать глубину секвенирования и количество копий вирусного генома (дополнительные сведения см. в разделе «Материалы и методы»).

  2) Основной вывод авторов заключается в том, что ICP4 не только связывает специфический мотив вирусных промоторов E на ранних стадиях инфекции, но и беспорядочно связывает поступающую вирусную ДНК. Хотя количественный анализ убедительно подтверждает их гипотезу, следует рассмотреть и более тщательно обсудить другие объяснения и, в частности, последствия их открытия. Следует отметить, что влияние ICP4 на доступность вирусного генома было довольно небольшим (в 2,8 раза по сравнению с 4-кратным).

  Мы добавили панель к рисунку 3, чтобы продемонстрировать отсутствие различий в занятости нуклеосом в отсутствие ICP4. Кроме того, мы повторили эксперимент ATAC-Seq с двумя дополнительными биологическими повторами, которые подтвердили исходные данные. Теперь мы скорректировали рисунок 3, включив в него все биологические повторы. Расчеты в таблице 3C были скорректированы с учетом новых данных. Теперь мы наблюдаем, что n12 и вирус WT имеют обогащение метки в 2,2 и 2 раза соответственно.

  В чем преимущество вируса, рекрутирующего ICP4 независимым от последовательности способом в вирусный геном? Как это способствует различиям в промоторах E и L? Авторам следует расширить свое обсуждение этого вопроса.

  Добавлено следующее:

  «Наше наблюдение, что ICP4 покрывает вирусный геном, уникальный фенотип рекрутирования для белка, который функционирует при рекрутировании GTF, вероятно, отражает архитектуру вирусного генома. […] Также возможно, что относительно высокая плотность ICP4 в вирусном геноме до репликации ДНК может служить для подавления транскрипции истинных поздних промоторов, которые содержат только сайты связывания для основных GTF. Было показано, что связывание ICP4 может в большей степени зависеть от репликации ДНК для экспрессии с относительно простых промоторов (Koop et al., 19).93; Ривера-Гонсалес и др., 1994).

  3) Авторы заявляют, что связывание ICP4 с клеточным геномом ограничивается доступными областями клеточного генома, а именно промоторными областями. Однако хорошо известно, что ICP4 связывается с медиатором, который демонстрирует ту же картину распределения, что и ICP4, в клеточных генах на ранних стадиях инфекции, как и ICP4. Поскольку специфические мотивы связывания ICP4 не объясняют связывание ICP4 с клеточными промоторными областями, альтернативное объяснение состоит в том, что ICP4 рекрутируется в клеточные промоторные области посредством его взаимодействия с Mediator (а не благодаря его ДНК-связывающей активности).

  Мы согласны с тем, что ICP4 может стабилизироваться при связывании с клеточными промоторами посредством хорошо известных взаимодействий с компонентами Mediator и TFIID. Однако это не умаляет способности ICP4 напрямую связывать двухцепочечную ДНК, которая хорошо известна in vivo и in vitro. Мы добавили следующее:

  «Кроме того, мы обнаружили, что ICP4 специфически связывается там, где отсутствуют гистоны, рядом с эухроматическими маркерами. […] GTF, присутствующие на этих клеточных промоторах, а именно комплекс TFIID и Mediator, могут дополнительно стабилизировать связывание ICP4 на этих промоторах посредством их хорошо охарактеризованных взаимодействий (Carrozza and DeLuca, 19).96; Лестер и Делука; Вагнер и ДеЛука, 2013 г.)».

  ATAC-seq также выявляет участки генома, которые становятся «доступными» независимо от медиатора. Авторы должны проверить совместную локализацию прочтений ICP4 с пиками ATAC-seq за пределами промоторных областей (без перекрывающихся прочтений Mediator).

  Мы поняли, что рисунок 5 — дополнение к рисунку 2 не был включен в PDF-файл, отправленный рецензентам, и мы это исправили. На рисунке 5 — дополнение к рисунку 2 мы показываем, что пики ICP4 были в основном локализованы (> 80%) в пределах 1 килобаз от промоторов мРНК, на которые есть ссылки в подразделе «Связывание ICP4 ограничено доступными областями клеточного генома». По этой причине мы ограничили наш анализ в статье промоторными областями.

  4) В разделе «Антитела» раздела «Материалы и методы» должно быть указано, что антитело Pol II специфично в отношении фосфорилированных остатков серина 5 CTD. Как правило, следует избегать использования клона 4H8 антитела Pol II в качестве показателя общей занятости pol II. Хотя этот клон обычно используется для измерения общей занятости pol II, фосфо-серин 5 обогащен по сравнению с общим pol II в промоторах и сайтах сплайсинга. Это предубеждение, во всяком случае, было полезным для авторов, поскольку они больше всего сосредоточились на промоторах, хотя это может помешать более глубокому анализу в будущем в отношении других этапов транскрипции или экспериментальных условий, в которых фосфорилирование серина 5 изменено. . Таким образом, важно, чтобы это смещение (заявленное на веб-сайте производителя) сразу бросалось в глаза читателю.

  Мы добавили следующее:

  «Во всех IP Pol II мы использовали антитело, которое преимущественно связывается с фосфо S5 С-концевой области повтора домена. Эта посттрансляционная модификация связана с Pol II, обнаруженным на промоторах мРНК и сайтах сплайсинга».

  «специфический для фосфо S5 повторяющейся области С-концевого домена»

  5) Авторы адаптировали шкалу оси Y на ряде рисунков, чтобы обеспечить лучшую визуализацию своих данных. Хотя это было сделано хорошо для большинства рисунков, некоторые корректировки масштаба затрудняют сравнение результатов. Например, на рис. 2В авторы показывают занятость polII, а также ТВР. на двух выбранных вирусных генах. К сожалению, ось Y резко различается между панелями, что очень затрудняет сравнение (например, Sp1 32 312 против 11 877). Эти различия также затрудняют сравнение мутантного n12 и вируса дикого типа на рис. 3 — дополнение к рисунку 3. Авторам следует стандартизировать шкалы по оси Y, чтобы можно было сравнивать панели и избегать ошибочных интерпретаций.

  Рисунок 2B и рисунок 3 — дополнение к рисунку 3A были скорректированы таким образом, чтобы оси Y для каждого IP были одинаковыми на всех панелях.

  6) Подраздел «ICP4 как фактор транскрипции вируса и хроматин»: в настоящее время неясно, происходит ли рекрутирование основных факторов транскрипции IE в поступающие вирусные геномы только при инфекции HSV или также при других герпесвирусах, например, ЦМВ-инфекция. Поэтому в настоящее время нет доказательств того, что это объясняет различия в кинетике литической репликации между разными герпесвирусами. Интересно, что относительный вклад экспрессии вирусных генов в течение первых 2 часов инфекции MCMV даже выше, чем наблюдаемый для HSV-1. Однако репликация ДНК MCMV не начинается до 12 ч p.i. тогда как он инициируется уже через 2 ч p.i. при инфекции ВПГ-1. Двух часов лечения интерфероном недостаточно, чтобы вызвать сильное защитное противовирусное состояние. Таким образом, реакция хозяина вряд ли предотвратит репликацию вирусной ДНК при инфекции MCMV, которая уже начинается через 2 ч после заражения. В совокупности это является сильным аргументом против важной роли рекрутирования ICP4 в вирусные геномы в объяснении различий в кинетике репликации между различными герпесвирусами. Принимая во внимание консервативный каскад экспрессии генов IE, E, L, можно предположить, что покрытие входящих вирусных геномов основным вирусным трансактиватором является консервативной особенностью герпесвирусов.

  Мы удалили предложение, относящееся к этому, в конце Обсуждения.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109.028

  Статья и информация об авторе

  Сведения об авторе

  1. Сара Э. Дремел

     Кафедра микробиологии и молекулярной генетики, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Питтсбург, США

     Вклад

     Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, Получение финансирования, Исследование, Методология, Написание — первоначальный проект, Написание — обзор и редактирование

     Конкурирующие интересы

     Конкурирующие интересы не заявлены «Этот ORCID iD идентифицирует автора этой статьи:» 0000-0003-0968-3090

  2. Нил ДеЛука

     Кафедра микробиологии и молекулярной генетики, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Питтсбург, США

     Вклад

     Концептуализация, Надзор, Привлечение финансирования, Исследование, Методология, Написание — первоначальный проект, Написание — обзор и редактирование

     Для корреспонденции

     ndeluca@pitt. edu

     Конкурирующие интересы

     Конкурирующие интересы не заявлены «Этот ORCID iD идентифицирует автора этой статьи:» 0000-0001-8381-8577

  Финансирование

  Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (R01AI30612)

  • Нил ДеЛука

  Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (F31AI36251)

  • Сара Э Дремел

  Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (T32AI060525)

  • Сара Э. Дремел

  Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (R21AI143179)

  • Нил ДеЛука

  Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и интерпретации данных или принятии решения о представлении работы для публикации.

  Благодарности

  Эта работа была поддержана грантами NIH AI030612 и AI143179.к НАД. SED был поддержан учебными грантами NIH T32AI060525 и F31AI36251. Мы благодарим сотрудников лаборатории DeLuca за вдумчивые обсуждения, связанные с этим проектом, и Фрэнсис Сиврич за техническую помощь.

  Старший редактор

  1. Джессика К. Тайлер, Weill Cornell Medicine, США

  Редактор-рецензент

  1. Стипан Йонич, Университет Риеки, Хорватия

  Рецензент

  1. Ларс Дёлькен, Университет Вюрцбурга, Германия

  История публикаций

  1. Поступило: 15 августа 2019 г.
  2. Принято: 9 октября 2019 г.
  3. Версия записи опубликована: 22 октября 2019 г. (версия 1)

  Авторское право

  © 2019, Dremel and DeLuca

  Эта статья распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает неограниченное использование и распространение при условии указания автора и источника.

  Метрики

  Счетчик цитирования статей, полученный путем опроса самого высокого числа из следующих источников: Scopus, Crossref, PubMed Central.

  Ссылки для скачивания

  Список ссылок, состоящий из двух частей, для загрузки статьи или частей статьи в различных форматах.

  Открытые цитаты (ссылки для открытия цитат из этой статьи в различных онлайн-сервисах управления ссылками)

  • Менделей
  • ЧитатьКуб»>

  Процитируйте эту статью (ссылки для загрузки цитат из этой статьи в форматах, совместимых с различными инструментами управления ссылками)

  1. Сара Э Дремел
  2. Нил ДеЛука

  (2019)

  Вирусный нуклеопротеин простого герпеса создает конкурентную транскрипционную среду, способствуя надежной транскрипции вируса и отключению хозяина

  eLife 8 :e51109.

  https://doi.org/10.7554/eLife.51109

  • Скачать БибТекс
  • Скачать . RIS

  Категории и теги

  • Исследовательская статья
  • Генетика и геномика
  • Микробиология и инфекционные болезни
  • ВПГ
  • ICP4
  • полII
  • транскрипция

  Исследовательские организмы

  • Человек
  • Вирус

  So böse lacht das Netz über den HSV

  Share Tweet E-Mail © https://twitter.com/Bremer86 © facebook/NJOY © https://twitter.com/GreenWhiteD © https://twitter.com/savvy91 © https://www.facebook.com/MarcosFussballecke © Hamburger Morgenpost © http://meinburger.mcdonalds.de/burger/21082260716523 © https://www.facebook.com/events/641000452664363/ © https:// twitter.com/Bremer86 © facebook/NJOY © https://twitter.com/GreenWhiteD © https://twitter. com/savvy91 © https://www.facebook.com/MarcosFussballecke © Hamburger Morgenpost © http://meinburger .mcdonalds.de/burger/21082260716523 © https://www.facebook.com/events/641000452664363/ © https://twitter.com/Bremer86

  Der norddeutsche Radiosender «NJOY» kann sich einen Seitenhieb gegen den HSV nicht verkneifen. В einer fingierten Whatsapp-Gruppe werden mögliche Retter-Kandidaten zusammengetragen. «Thomas Tuchel hat die Gruppe verlassen» spricht dabei für sich.

  Nächste Bundesliga-Spiele: Wer ist Favorit?

  Wer überträgt die Бундеслига 2022/23 в прямом эфире?

  In der Bundesliga-Saison 2022/2023 gelten die gleichen Übertragungsrechte wie in der Vorsaison.

  Bundesliga im Free TV bei SAT.1
  Auch in der Saison 2022/23 Zeigt запускал insgesamt neun Partien der Bundesliga und 2. Bundesliga live in SAT.1 und im Livestream. Alle Tore, Ergebnisse und Tabellen gibt es auf  ran.de  в Echtzeit. Neben der Konferenz aller Spiele sind auch alle Einzelspiele im Liveticker abrufbar.

  Bundesliga bei Sky
  Sky ist und bleibt der größte Übertragungspartner der Deutschen Fußball Liga. Der Pay-TV-Sender Hält die Rechte für alle Spiele am Samstag sowie für die Spiele der English Wochen, die dienstags und mittwochs stattfinden. Auch die Konferenz bleibt im Sky-Programm erhalten.

  Bundesliga beim Streaming Dienst DAZN
  Jedes Freitags- und Sonntagsspiel der Saison läuft exklusiv auf DAZN. Freitags immer um 20.30 Uhr, sonntags an bis zu drei Anstoßzeiten um 15:30 Uhr, 17:30 Uhr und 19:30 Uhr.

  Bundesliga bei der ARD
  ARD ist mit der Sportschau am Samstagabend в 18:30 Uhr mit der Bundesliga am Start und Zeigt die Zusammenfassungen und Highlights aller Spiele der Bundesliga und der Samstagsspiele der 2. Bundesliga. Am Sonntag в 21:15 Uhr dürfen die ARD und ihre Regionalsender die Highlights / Zusammenfassungen der bis zu drei Sonntagsspiele im frei empfangbaren Fernsehen präsentieren

  Bundesliga beim ZDF
  Am späten Samstagabend, zwischen 21:45 und 24:00 Uhr, gibt es im ZDF die Nachberichterstattungen der Spieltage der 1. und 2. Liga sowie die Erstverwertung der Highlights des Abend Bundesliga-Topspiels im TV.

  ---

  Хотите начать Бундеслигу Сезон 2022/23?

  Die Bundesliga startet am 05 августа 2022 г., die 2. Liga bereits drei Wochen zuvor am 15 июля 2022 г. 

  Die wichtigsten Eckdaten der Saison 2022/23:

  Bundesliga, 1. Spieltag: 05.-07.08.2022 (Das Eröffnungsspiel zwischen Eintracht Frankfurt und dem FC Bayern München wird live in SAT.1 und auf ran.de zu sehen sein)

  Bundesliga, 5.0006 Bundesliga, 5.0.08. .2023

  2. Бундеслига, 1. Серия: 15.-17.07.2022

  2. Бундеслига, 34. Серия: 28.05.2023

  ---

  Wer spielt am 4. Spieltag der B03/2 Bundesliga 2?20/2

  Der 4. Spieltag in der Bundesliga steht an. Gespielt wird von Freitag 26 августа до Sonntag 28 августа. Topspiele sind sicherlich der Hertha gegen den BVB (Samstag 15:30 Uhr), Schalke daheim gegen Union (Sa. 15:30 Uhr) und am Samstag Abend um 18:30 Uhr die Partie der Gladbacher Borussia beim FC Bayern München. Hier gibt es die completen Spielpläne der Bundesliga und der 2. Liga.

  Der 4. Spieltag der Hinrunde im Überblick:
  Freitag, 26 августа 2022 г.

  SC Freiburg — VFL Bochum
  ANSTOß: 20:30 UHR
  СТАДИН: Europa -Park Stadion (Freiburg)
  Live Liv ran.de  und im Livestream bei  DAZN ab 20 Uhr

  Samstag, 27. август 2022

  Schalke 04 — 1.FC Union Berlin
  ANSTOß: 15:30 UHR
  Стадион: VELTINS ARENA (Gelsenkirchen)
  Bundesliga Live: AB 15:00 UHR FCRCHEN)
  Bundesliga Live: AB 15:00 UHR FCLKEN)
  Bundesliga Liv auf  ran.de  и прямой эфир в TV & Stream bei Sky in der Konferenz oder als Einzelspiel

  Hertha BSC Berlin — Borussia Dortmund
  Anstoß: 15:30 Uhr
  Stadion: Olympia Stadion (Berlin)
  Bundesliga в прямом эфире: в 15:00 Uhr Hertha vs. BVB – im  Liveticker  auf  ran. de  und live im TV & Stream bei Sky in der Konferenz oder als Einzelspiel

  RB Leipzig — VFL Wolfsburg
  ANSTOß: 15:30 UHR
  СТАДИОН: Red Bull Arena (Leipzig)
  Bundesliga Live: AB 15:00 Uhr Rbl vs. vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -vsl -rblzig)
   и прямой эфир через TV & Stream bei Sky in der Konferenz oder als Einzelspiel

  FSV Mainz 05 — Bayer 04 Leverkusen
  ANSTOß: 15:30 UHR
  СТАДИОН: MEWA ARENA (MAINZ)
  Bundesliga Live: AB 15:00 UHR M05 VS. VS. VS. rand04 —
  — Bundesliga Live: AB 15:00 Uhr M05 vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. Vs. rand04 —
  . de  и live im TV & Stream bei Sky in der Konferenz oder als Einzelspiel

  1899 Хоффенхайм — ФК Аугсбург
  Anstoß: 15:30 Uhr
  Stadion: PreZero Arena (Sinsheim)
  Бундеслига live: ab 15:00 Uhr 1899 по сравнению с FCA — im  Liveticker  auf  ran. de und live im TV & Stream bei Sky in der Konferenz oder als Einzelspiel

  Бавария Мюнхен — Боруссия М’gladbach
  Анстоспорт: 18:30 UHR
  СТАДИН: Alnianz Arena (München)
  Bundesliga Live: AB 15:00 Uhr vhr vhr vhr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vshr vs. ran. de  и прямые трансляции с TV и Stream bei Sky в HD и UHD

  Sonntag, 28 августа 2022 г.

  1.FC Köln — VfB Stuttgart 
  Anstoß:  15:30 Uhr
  Stadion:  Rhein Energie Stadion (Köln)
  Bundesliga live: ab 15:00 Uhr 1.FC Köln vs. VfB — im  Liveticker auf ran.de und im Livestream bei DAZN в 15:00 Uhr

  Вердер Бремен — Айнтрахт Франкфурт
  Ответ: 17:30 Uhr
  Стадион: Wohninvest Weserstadion (Бремен)
  Bundesliga live: ab 17:00 Uhr SVW vs. SGE — im  Liveticker  auf  ran.de  und im Livestream bei  DAZN ab 17:00 Uhr

  ---

  Wie sind die Anstoßzeiten in der Бундеслига-Сезон 2022/23?

  In der Bundesliga-Saison 2022/23 wird es einige Änderungen bei den Anstoßzeiten geben. Das späte Sonntagsspiel wird nicht um 18 Uhr, sondern um 17:30 angepfiffen. Zudem wird es zehn Spiele am Sonntag в 19:30 Uhr geben. Die Montagsspiele падший dagegen weg. Die Freitagsspiele finden wie gewohnt um 20:30 Uhr statt und auch am Samstag werden die Partien wie gewohnt um 15:30 Uhr und um 18:30 Uhr angepfiffen.

  ---

  Die nächsten Spiele & Termine

  Бундеслига 2022/2023

  Spieltag 87 bis 10

  5 5

  30.09.2022

  — 02. 10.2022

  8. Шпильтаг Хинрунде Бундеслига

• 07.10.2022

  — 09.10.2022

  9. Шпильтаг Хинрунде Бундеслига

• 14.10.2022

  — 16.10.2022

  10. Шпильтаг Хинрунде Бундеслига

Top Spiele Bundesliga — 8. Spieltag vom 30.09. до 02.10.2022

• 30.09.2022

  20:30

  Бавария — Леверкузен 20:30 Ур 20:30 Бундеслига 2022/2023 Хинрунде Мюнхен — Альянц Арена

• 01. 10.2022

  15:30

  Кельн — Дортмунд 15:30 Ур 15:30 Бундеслига 2022/2023 Хинрунде Кельн — Стадион Rhein Energie Stadion

• 01.10.2022

  18:30

  Бремен — Гладбах 18:30 Ур 18:30 Uhr Bundesliga 2022/2023 Hinrunde Bremen — Wohninvest Weserstadion

• 02.10.2022

  17:30

  Шальке 04 — Аугсбург 17:30 Ур 17:30 Бундеслига 2022/2023 Хинрунде Гельзенкирхен — Фельтинс Арена

Украина-Hilfe

Push-уведомления

запустил Fire-TV-App

Tabelle

#		Mannschaft	Mannschaft	Mannschaft	Sp.	S	U	N	Тор	Диф.	шт.
1		1. FC Union Berlin	Union Berlin	FCU	7	5	2	0	15:4	11	17
2		Borussia Dortmund	Dortmund	BVB	7	5	0	2	9:7	2	15
3		SC Freiburg	Freiburg	SCF	7	4	2	1	10:5	5	14
4		1899 Hoffenheim	Hoffenheim	TSG	7	4	1	2	12:7	5	13
5		Bayern München	Bayern	FCB	7	3	3	1	19:6	13	12
6		Бор. Менхенгладбах	М’гладбах	BMG	7	3	3	1	10:5	5	12
7		Eintracht Frankfurt	Frankfurt	SGE	7	3	2	2	14:13	1	11
8		1. FSV Mainz 05	Mainz 05	M05	7	3	2	2	7:10	-3	11
9		1. FC Köln	Köln	KOE	7	2	4	1	11:8	3	10
10		Werder Bremen	Werder	SVW	7	2	3	2	13:12	1	9
11		FC Augsburg	Augsburg	FCA	7	3	0	4	5:10	-5	9
12		RB Leipzig	RB Leipzig	RBL	7	2	2	3	9:12	-3	8
13		Hertha BSC	Hertha BSC	BSC	7	1	3	3	7:9	-2	6
14		FC Schalke 04	Schalke	S04	7	1	3	3	8:14	-6	6
15		Bayer Leverkusen	Leverkusen	B04	7	1	2	4	9:12	-3	5
16		VfB Stuttgart	Stuttgart	VFB	7	0	5	2	7:10	-3	5
17		VfL Wolfsburg	Wolfsburg	WOB	7	1	2	4	5:12	-7	5
18		VfL Bochum	Bochum	BOC	7	0	1	6	5:19	-14	1

• Champions League
• Europa League
• Europa Conference League Quali .
• Понижение
• Абстиг

Бегущая строка

Бундеслига

Фанатская проблематика: Габриэль Зихт Verschiebung 6 9000 900 Gewalt

472 Bundesliga

Schiedsrichter-Boss Fröhlich räumt Fehler ein

Bundesliga

kicker: Bayern hat Kontakt mit Kane aufgenommen

Nations League

Flick: «England ist fantastisch»

Nations League

Trotz großer Erwartungen: Musiala verspürt keinen Druck

Лига Наций

Niederlage im «Endspiel»! Rangnick Steigt mit Österreich ab

2. Bundesliga

St.-Pauli-Boss Göttlich fordert Lösung für «Systemsprenger»

Fussball international

Barca-Star kassiert wohl mehr als Ronaldo und Lewandowski

Fußball-WM

Bundeskanzler Scholz sieht «Fortschritte» в Катаре

Fussball international

Nach Krebstherapie: Nationaltorhüterin Berger gibt Comeback

mehr anzeigen

Video-Tipps

Футбольный мяч

Гигантское лазерное шоу: Pizarro hat immer geliefert

13 мин.

Футбольный мяч

Ein letztes Mal! Gänsehaut Bei Pizarros Auswechslung

2:38 мин.

Fussball

RUPIVE: DAS ABSCHEDSSPIEL VON CLAUDIO PIZARRO

155 MIN

Galerie

HERPès DE LO). Герпес (вирус герпеса)

• Популярные темы
  • Атмосферное загрязнение
  • Заболевание коронавирусом (COVID-19)
  • гепатит
• Liste alphabétique
• A
• B
• C
• D
• E
• F
• G
• H
• I
• J
• K
• L
• M
• N
• O
• Р
• Р
• Р
• С
• Т
• У
• В
• Вт
• X
• Y
• Z
• Сотрудничество с платежами
  • Деятельность по оплате
  • Репортажи о платежах
• Регионы
  • Африка
  • Америка
  • Asie du Sud-Est
  • Европа
  • Восточное Средиземноморье
  • Тихоокеанский запад
• Центр СМИ
  • Пресс-релизы
  • Декларации
  • Информационные примечания
  • Комментарии
  • Репортажи
  • Вопросы-ответы
  • Повестка дня
  • Репортажи
  • Контакты для СМИ
  • Вопросы и ответы
• Актуальная информация по OMS
• Санитарные нужды
• Актуальные
  • Nouvelles sur l’épidémie de maladie
  • Dossier épidémiologique hebdomadaire
• Données à l’OMS »
• Бордовые картины »
  • Таблица борьбы с COVID-19
• Faits парусники »
• А по поводу
  • Генеральный директор
  • Qui nous sommes
  • Ce que nous faisons
  • Où travaillons-nous
• Управление
  • Всемирная ассамблея де ла Санте
  • Исполнительный совет
• Страница накопления/
• Центр СМИ/
• Главный представитель/
• Деталь/
• Герпес (вирус герпеса)

Principaux faits

• Вирус герпеса, разделенный на две категории, вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) и вирус простого герпеса типа 2 (HSV-2).
• Le HSV-1 se transmet mainment par contact des muqueuses buccales et provoque l’herpes orofacial/labial (dont l’un des symptômes peut être le «bouton de fièvre»), mais aussi l’herpes genital.
• ВПГ-2, передающийся половым путем, по происхождению генитальный герпес.
• По оценкам, в мире 3,7 миллиарда человек из 50 человек (67 % населения) не инфицированы ВПГ-1.
• По оценкам, в мире 491 миллион человек в возрасте от 15 до 49 лет (11% населения) не инфицированы ВПГ-2.
• Группа оральных и генитальных инфекций по части бессимптомного вируса герпеса.
• Инфекция, вызванная вирусом HSV-2, увеличивает риск заражения или передачи инфекции VIH.

Vue d’ensemble

Инфекция, вызванная вирусом Herpes simplex, appelée herpes, est courante dans le monde. Вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) передается в основном при контакте со слизистой оболочкой щеки и провоцирует инфекции внутренних или наружных половых органов (орофациальный/лабиальный герпес), главным образом вызывая генитальный герпес. ВПГ-2 передается главным образом половым путем и провоцирует генитальный герпес.

Qu’elles soient orales ou genitales, герпетические асимптоматические инфекции или reconnues la plupart du temps, mais elles peuvent provoquer des vesiculaires ou ulcéreuses douloureuses, de benignes à sévères, sur le site infect. Il existe des médicaments permettant de réduire la sévérité et la frequence des symptômes, mais ils ne peuvent pas guérir l’infection.

Рецидивирующие симптомы герпеса орофациальный/лабиальный или генитальный peuvent provoquer un mal-être. L’herpes génital peut également être consideré Comme Stigmatisant et Avoir un Impact sur les rapports sexuels. Toutefois, avec le temps, la plupart des personnes atteintes de l’un ou l’autre type d’herpes apprennent à vivre avec l’infection.

Ampleur du problème

En 2016 (dernières données disponibles), по оценке 3,7 млрд человек из 50 человек, что составляет 67 % населения, отсутствие инфекции HSV-1 (щечная или гениальная зона) . La plupart des инфекций à HSV-1 sot Contractées подвесной l’enfance.

Pour ce qui est de l’infection genitale à HSV-2, по оценке 491 миллиона человек (13 %) в возрасте от 15 до 49 и en étaient atteintes dans le monde (données de 2016). Les femmes sont presque deux fois plus souvent infectées par le HSV-2 que les hommes, car la передача sexuelle est plus efficace de l’homme à la femme. La prévalence augmente avec l’âge, même si l’on наблюдать ле плюс большое имя новых инфекций среди подростков.

Признаки и симптомы

Орофациальный/лабиальный герпес является наиболее асимптоматической, главными симптомами, связанными с везикулярными поражениями или высыпаниями (язвами) douloureuses à l’intérieur ou autour de la bouche (boutons de fièvre). Les sujets infectés ressentent souvent des picotements, des démangeaisons ou des sensations de brûlure autour de la bouche, avant l’apparition des lésions. Ces symptômes peuvent réapparaître de temps en temps et la frequence de ces récidives varie d’une personne a l’autre.

Генитальный герпес, проявляющийся асимптоматикой или сопутствующим симптомом генитального герпеса, который вызывает подозрения. Lorsqu’il y a des symptômes, il se caractérise par une ou plusieurs lésions vésiculaires ou ulcéreuses génitales ou anales. En outre, les symptômes d’une nouvelle инфекции comprennent souvent de la fièvre, des courbatures et un gonflement des лимфатических ганглиев. Après un épisode initial parfois sévère, des récidives peuvent se produire. В общем, генитальный герпес, вызываемый ВПГ-1, часто воспроизводится. Dans le cas du HSV-2, les symptômes récurrents sont frequents. Toutefois, les récidives sont souvent moins sévères que lors du premier épisode et ont tenance à diminuer avec le temps.

Передача

ВПГ-1 передается главным образом при контакте со щечными слизистыми оболочками, вызывая наличие вирусных частиц в слюнных железах, слюне и поверхностях щечной области, губных или периоральных. Moins souvent, le HSV-1 peut également être transmis à la genitale, lors des rapports oro-génitaux ; il provoque alors un генитальный герпес. Le HSV-1 peut себе transmettre à partir де поверхности buccales ou cutanées semblant normales, néanmoins, ле risque де передачи ЭСТ максимальный en présence де évolutions de lésions évolutives. Les personnes ayant déjà une инфекция HSV-1 n’ont aucun risque de la Contractor de nouveau, mais elles courent toujours le risque de Contractor le HSV-2.

Подвеска HSV-2 с основным механизмом передачи для половых контактов, контактная часть с поверхностями женских половых органов, половым органом, играми или секрециями жидкости, вызванной инфекцией. Il peut être transmis à partir d’une peau d’apparence normale dans la zone génitale ou anale et la передача a souvent placeu en l’absence de symptômes.

Редкий случай, когда человек переносит генитальный герпес на HSV-1 в новой подвеске.

Возможные осложнения

HSV-2 et VIH

Инфекция HSV-2 multiplie presque par trois le risque de Contractor une nouvelle инфекция à VIH. De plus, ceux qui ont simultanément les des deux инфекций ont une probabilité plus grande de transmettre le VIH. Le HSV-2 fait partie des инфекцияs les plus courantes parmi les personnes vivant avec le VIH.

Могилы форм

Chez les sujets иммунодефицит, notamment en cas d’infection à VIH à un avancé, les symptômes de l’herpes peuvent être plus grands et les récidives plus frequentes. Le HSV-2 peut entraîner des осложнения редкие comme la meningo-encéphalite (инфекция du cerveau) ou une инфекции disseminee. Rarement, на peu aussi Observer des осложнений плюс sévères comme une encéphalite ou une keratite (инфекция глаза).

Неонатальный герпес

Неонатальный герпес Наблюдение за новорожденным, выявленное на подвеске ВПГ. Это редкое заболевание, которое выживает в окружающей среде 10 accouchements sur 100 000 au plan mondial, mais peut entraîner une incapacité neurologique durable ou le décès. Le risque est le plus élevé lorsque la mère Contracte pour la première fois l’infection à HSV à un stade tardif de la gresse.

Traitement

Противовирусные препараты, такие как ацикловир, фамцикловир и валацикловир, более эффективные для лиц, инфицированных вирусом герпеса (см. рекомендации по OMS). Ils aident à réduire la gravité et la frequence des symptômes mais ne peuvent pas guérir l’infection.

Профилактика

При симптомах орофациального герпеса, при контакте с буккальным отделом брюшной полости (и включает половые связи половых органов и половых органов) и при контакте с слюной. Il faut également s’abstenir de tout rapport sexuel tant que ces symptômes sont presents. Le HSV-1 et le HSV-2 sont les plus contagieux si les symptômes comportent des playes, mais ils peuvent aussi se transmettre en l’absence de symptômes visibles ou ressentis.

Pour les personnes sexuellement actives, l’regulière et correcte des preservatifs est le seul moyen de prévenir l’herpes genital ou d’autres, передающиеся половым путем инфекции. Néanmoins, il peut y avoir une инфекции par le HSV du fait du contact avec les party genitales ou anales qui ne sont pas recouvertes par le préservatif. La circoncision médicale peut également protéger l’homme à vie, mais partiellement, contre le HSV-2, en plus du VIH et du papillomavirus.